[发明专利]一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高效的运用重组工程手段实现大肠杆菌基因组点突变的方法。

背景技术

大肠杆菌是遗传学研究的最为透彻的微生物菌株，广泛用于生物学的基础研究。大肠杆菌同时也是工业生产中最重要的微生物菌株之一，是合成生物学和代谢工程的首选菌株。大肠杆菌在生产药物、精细化工产品以及具工业催化价值的酶等方面有着广泛的用途。这些实际的功能均与基因组上的基因密切关联，因此阐述这些基因的功能和改善这些基因的品质是发挥大肠杆菌功能的重要途径。在诸多研究手段中，基因组的点突变（即基因位点的点突变）是关键的一种。

经典的大肠杆菌基因组点突变的方法有两种。均首先是通过重叠－延伸聚合酶链式反应等方法将引入突变位点的基因克隆在载体上，突变位点两侧含有与基因组序列一致的同源片段（设为A和B)。第一种方法选择的是含有温度敏感型复制子的载体。大肠杆菌的生长温度是37°C，温度敏感型复制子只能在30°C时进行复制，在37°C时，含温度敏感型复制子的质粒因为不能复制而失去。当含有突变位点的含温度敏感型复制子的质粒转化至大肠杆菌后，首先在30°C培养，通过抗性选择得到质粒游离于基因组的菌株，随后提高培养温度至37°C或42°C，迫使质粒通过突变位点一侧的同源片段（任为A或B)整合至基因组上，随后在30°C之下进行培养，筛选失去抗性（即失去质粒的）菌株，此时菌株有两种类型，一种类型是用于第一步整合的片段（A或B)再次用于发生同源重组，而得到回复至原株基因组的菌株；另外一种类型是第二个同源片段（第一次为A，则此时为B；第一次为B，则此时为A）发生同源重组，而得到目的位点发生突变的突变株。第二种方法选择的是含有不能在常规大肠杆菌中复制的复制子（如需要Pir蛋白才能复制的R6K复制子）和含有负筛选标记的质粒。一种典型的负筛选标记是编码6-果糖基转移酶的sacB基因，含有此基因的菌株（在质粒上或基因组上）不能在含10%的蔗糖培养基中生存。将克隆有突变位点和同源片段的重组质粒转化至大肠杆菌后，由于质粒不能复制，在抗性筛选之下，迫使突变位点一侧的同源片段（任为A或B)整合至基因组上。随后将菌株在负筛选的条件下进行培养，与第一种方法类似，如相同的同源片段再次发生同源重组，则得到原株基因型的菌株；如不同的同源片段方式重组，则得到目的位点发生突变的菌株。由此可见，这两个经典的方法的不足是：1.因为所需的同源片段较长（一般需1kb），故需要步骤烦琐和耗时长的基因克隆步骤；2.在最终菌株中发生突变的比例可能相差较大，即需要筛选较多的克隆才能得到正确的突变株。

随着重组工程方法学的兴起，直接合成含突变位点的寡核苷酸，将之转化大肠杆菌后筛再选点突变的菌株成为可能。重组工程一般使用来源于lambda噬菌体的三个基因。其中exo基因编码5'->3外切酶，其作用于双链DNA而得到3'端突出的DNA分子；bet基因编码3'突出端的单链结合蛋白，同时促进同源片段之间的同源重组；gam基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，使得转化的DNA分子免受菌株本身的核酸酶所降解，这三个基因共同行使重组酶的活性。重组工程突出优点是可以催化短至36bp之间的同源片段（称为同源臂）之间的同源重组而实现DNA的克隆和修饰。突变寡核苷酸的方法虽然简便，但迄今报道的突变率往往很低，在1%左右甚至更少，这就需要筛选大量的克隆才能得到正确的突变株。因此突变寡核苷酸的方法目前只具有基础研究意义，目前难以推广应用。

发明内容

为克服上述不足，本发明申请提出了一种基于重组工程的大肠杆菌基因组的点突变方法。

本方法的基本原理是首先通过重组工程的手段在基因组上引入含突变位点（单个或数个碱基）、30bp同源片段、两侧为归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因，随后诱导表达的I-SceI作用于整合在基因组上的I-SceI酶切位点，促使30bp同源片段之间发生同源重组而将一个30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点和卡那霉素抗性基因去除，最终得到不含有任何冗余序列的、发生点突变的大肠杆菌突变株。

本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

（1）通过重叠-延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段，所述DNA修饰片段依次由下列结构组成：基因组上靶位点（即待突变位点）上游50bp序列一致的50bp同源臂、突变位点（即突变成功的位点）、与靶位点下游30bp序列一致的30bp同源片段、两侧为两个归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因、与靶位点下游50bp序列一致的50bp同源臂；