[发明专利]霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及致病菌的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

霍乱弧菌(V.cholera)是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或食物尤其是水产品经口感染。近年来随着国家贸易全球化的不断加剧，我国的进出口贸易逐年增长。而在进口的食品中，出现问题最多的是鲜活或冰冻的水产品。例如，2005年和2006年进口水产品中副溶血性弧菌的检出率为9％左右，霍乱弧菌的检出率为2％～3％，其他的弧菌如创伤弧菌等也时有检出。而且我国长期以来所形成的饮食习惯，对一些水产品如龙虾、象拔蚌和三文鱼等一般生吃，从而对消费者的健康造成潜在威胁，所以有必要加强对水产品中常见致病性弧菌的检测。

霍乱弧菌包含多种毒力相关因子，其中霍乱毒素(CT)是其主要的致病因子。自环境中分离出的霍乱弧菌多数不产生CT。01群和0139群霍乱弧菌是引起疾病发生的两种主要血清型，另外，近年来的研究显示部分非01、非0139的霍乱弧菌也可以产生CT。因此，分离鉴定食品中的霍乱弧菌对保护人民健康，保障水产品的安全具有重要的意义。

目前常用的霍乱弧菌检测方法包括：1)传统的培养方法。总体可分为4个阶段或步骤。预增菌，选择性增菌，分离，生化鉴定。需要4～7天，才能得出明确的诊断结果。2)免疫标记技术。利用抗原抗体的特异性反应，并结合一些生物化学或物理学方法进行检测，但该方法的灵敏度和特异性均较差。3)分子生物学检测方法。目前有PCR技术，实时荧光定量PCR和LAMP方法。以上几种方法易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，并且不能区分活菌和死菌，阻碍了其大规模推广使用。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类致病菌的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析致病菌的特性进行专门设计。目前尚无针对霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

为解决现有的霍乱弧菌(VC)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的霍乱弧菌(VC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝的VC检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述VC靶标核酸(VC RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VC检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的霍乱弧菌(VC)的靶标核酸(VC RNA)序列特异结合，在有VC内标(VC IC RNA)时，其最好还可与该VC内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和VC检测探针存在于一VC检测液中。