[发明专利]特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP1A2基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP1A2基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP1A2基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP1A2基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。

2.根据权利要求1所述的特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：所述CYP1A2基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-CCGCTCGAGATGGCATTGTCCCAGTCTGTTC-3’（SEQ ID NO：1），所述下游引物的序列为：5’-ACCCGGGTCAGTTGATGGAGAAGCGCAGC-3’（SEQ ID NO：2）。

3.根据权利要求 2所述的特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）CYP1A2基因引物设计：根据CYP1A2基因的CDS序列，使用Oligo 7分析后选取5’-CCGCTCGAGATGGCATTGTCCCAGTCTGTTC-3’（SEQ ID NO：1）作为上游引物，选取5’-ACCCGGGTCAGTTGATGGAGAAGCGCAGC-3’（SEQ ID NO：2）作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物； 

B）CYP1A2基因cDNA序列的获得：用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获得大量CYP1A2基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP1A2基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP1A2基因cDNA序列的pGM-T载体，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用XmaⅠ酶切，电泳、切胶回收约1600 bp大小的片段，此片段即为CYP1A2基因cDNA序列；

C）特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定：提取质粒pLVX-AcGFP1-C1，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用XmaⅠ酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase将所述CYP1A2基因cDNA序列连接到pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP1A2基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；

D）特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒载体的抽提：将测序结果证实CYP1A2基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。