[发明专利]特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。 

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP1A2属于CYP450家族中的CYP1A亚族，由CYP1A2基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的13％，仅次于CYP3A和CYP2C亚家族，居肝脏各CYP酶含量的第三位。CYP1A2在肠道、脑、肺等组织中也有少量分布。CYP1A2参与咖啡因、华法林、茶碱、普萘洛尔、美西律、维拉帕米、硝苯地平、他克林等20多种药物的代谢过程，同时也负责一些内源性激素的羟化反应。此外，CYP1A2在一些前致癌物和前毒性物质的体内活化过程中也起重要作用。 

现有技术中，阮昊将CYP1A2基因cDNA片段连接到了pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP1A2基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP1A2基因的载体。 

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和Xma I酶切位点的CYP1A2基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进人源肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本发明。 

本发明提供一种特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP1A2基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP1A2基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP1A2基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP1A2基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。 

采用上述技术方案，本发明提供的CYP1A2基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1 表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP1A2基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP1A2基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。 

作为本发明的进一步改进，所述CYP1A2基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-CCGCTCGAGATGGCATTGTCCCAGTCTGTTC-3’(SEQ ID NO：1)，所述下游引物的序列为：5’-ACCCGGGTCAGTTGATGGAGAAGCGCAGC-3’(SEQ ID NO：2)。采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP1A2基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中持续表达CYP1A2基因，减少了序列合成费用，成本较低。 

相应的，本发明还提供特异促进肝细胞CYP1A2基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤： 

A)CYP1A2基因引物设计：根据CYP1A2基因的CDS序列，使用Oligo 7分析后选取5’-CCGCTCGAGATGGCATTGTCCCAGTCTGTTC-3’(SEQ ID NO：1)作为上游引物，选取5’-ACCCGGGTCAGTTGATGGAGAAGCGCAGC-3’(SEQ ID NO：2)作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小；