[发明专利]滇青冈与牛肝菌纯共生体的建立方法

权利要求书

1.一种滇青冈与牛肝菌纯共生关系的建立方法，其特征为，利用野外采集的滇青冈(Cyclobalanopsis glaucoides )种子培养无菌苗，诱导愈伤组织，利用野外采集的美味牛肝菌(Boletus edulis s.l.)子实体诱导菌丝体，将愈伤组织与菌丝体进行共培养，室内建立共生关系，主要包括下列步骤：

（1）滇青冈愈伤组织的诱导及培养：于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl₂溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进萌发培养基，每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养9～12天后开始萌发，转入2000～ 2500Lux的光照下培养20～23天，长成8～10cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养10～13天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，30～35天愈伤组织直径达2.0～3.0 cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基中，19～23天，形成疏松的团块状组织，48～51天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；

（2）美味牛肝菌菌丝体的诱导及培养：于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm²的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基进行扩大培养；

（3）滇青冈愈伤组织与牛肝菌菌丝体的共培养：将上面已继代生长30～35天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，30～35天建立起一个无菌稳定的共生体系。

2.根据权利要求1所述的滇青冈与牛肝菌共生关系的建立方法，其特征在于步骤（1）中的

滇青冈种子萌发培养基为：MS培养基，无糖，6-BA 1.00～1.50mg/L，NAA 0.08 ～0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.80～1.00mg/L，IAA2.00～2.50 mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.40～5.60；愈伤组织继代培养基为：MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.80～1.00 mg/L，NAA 1.50～2.00mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.40～5.60。

3.根据权利要求1所述的滇青冈与牛肝菌共生关系的建立方法，其特征在于步骤（2）中的

美味牛肝菌菌丝体的诱导培养基为：马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO₄1.00g/L、CaCl₂1.00g /L、KH₂PO₄0.50g/L、NH₄NO₃ 0.40g/L、KNO₃ 0.40g /L、V_B1 0.10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40；扩大培养基为：淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨 4.13g/L，MgSO₄1.00g /L，CaCl₂ 1.00g /L，KH₂PO₄ 0.50g /L，V_B1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40。

4.根据权利要求1所述的滇青冈与牛肝菌共生关系的建立方法，其特征在于步骤（3）中的共培养培养基为：1/2MS培养基，蔗糖 10.00～13.00 g/L，淀粉 2.00～3.00g/L，葡萄糖1.00～2.00g/L，蛋白胨 2.00～3.00g/L，V_B1 0.05～0.10mg/L，谷氨酸 0.08～0.12g/L，6-BA0.80～1.00 mg/L，NAA1.70～2.50 mg/L，琼脂 8.00～10.00 g/L，pH 5.4～5.6。