[发明专利]奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法

权利要求书

1.用于奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法的引物，其特征在于，包括针对SNP位点的特异性PCR引物和测序引物，所述特异性PCR引物的序列为：

上游引物CD18F1：5‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’，

下游引物CD18R2：5‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’，且5’端用生物素标记，

测序引物S2：5‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。

2.奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，利用根据权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用试剂盒方法提取奶牛血液样本基因组DNA；

（2）以步骤（1）获得的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的特异性PCR引物为引物，配置PCR Mix反应体系；

（3）按照标准操作对步骤（2）获得的PCR产物进行单链的分离纯化和焦磷酸测序。

4.根据权利要求2或3所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体步骤为：

①吸取300μL新鲜血液，加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，放置5min，放置期间颠倒混匀几次，10000r/min离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；

②加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

③加入200μL缓冲液GB，剧烈颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心；

④加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心；

⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑦向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑧向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液；

⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

⑩将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱液TE，室温放置5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中，管中为提取的牛血液基因组DNA，置于-20℃保存。

5.根据权利要求2-4之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的PCR Mix反应体系为：25μL 2×PCR TaqMix、1μL上游引物CD18F1、1μL下游引物CD18R2、2μL牛血液基因组DNA、21μLddH2O；PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，45-50个循环，72℃5min。

6.根据权利要求2-5之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为50个循环。

7.根据权利要求2-6之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的量在50μL的PCR反应体系中为5-10pmol。