[发明专利]奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及奶牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）的检测方法，特别涉及一种奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序（Pyrosequcing）检测方法。

背景技术

奶牛白细胞黏附缺陷症（bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD）是一种发生于发生于荷斯坦（Holstein）奶牛的隐性遗传性免疫缺陷疾病，由常染色体上CD18基因单碱基突变(A→G)引起，病因为CDl8基因表达缺陷，隐性基因纯合时引起临床发病，主要以严重的重复性感染，脓液形成减少，伤口愈合迟缓和白细胞增多为特征。近30年来，我国从美国、加拿大及澳大利亚等进口大量的活牛，其中大部分为荷斯坦牛，由于BLAD有害基因多以杂合的状态存在，携带者并不发病，加之对此病没有足够的认识和重视，不可避免地引入大量潜在的BLAD携带者，而携带者表现正常，很难发现，一旦被发现时，其已经在畜群中进行了长时期的传播，给我国养牛业和乳制品行业的发展带来了重大的经济损失。BLAD遗传缺陷的发现已引起了各国奶牛育种协会和育种工作者的重视，美国、日本、丹麦、荷兰等国已相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种计划，将BLAD造成的损失降低。我国拥有700万头以上的荷斯坦奶牛，由于缺乏简便有效的BLAD隐性有害基因的检测方法，无法开展常规检测和大规模的普查统计，因此对我国牛群中BLAD的发病和携带情况尚不十分清楚，也就更谈不上从牛群中净化BLAD。

在对BLAD CD18基因的分析中，现有方法主要有PCR-SSCP，PCR-RELP和RT-PCR等。PCR-RFLP即聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerasechain react ion-restriction fragment length polymorphism)，因为DNA的多态性，不同的等位基因使DNA的限制性内切酶位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，有些位点能切开，有些不能，使酶切后产生的片段数目和每个片段的长度不同，用琼脂糖凝胶电泳判断酶切位点是否有效，从而区别不同基因位点。王洪梅等（王洪梅，李建斌，许尚忠等。中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症检测方法的研究进展[J].生物技术通报。2007，3:155-158）对济南市11个奶牛场356头奶牛及53头Holstein种公牛进行了BLAD的PCR-RFLP检测（Kehrli MEJr,Schmalstieg FC,Anderson DC,Van der Maaten MJ,Hughes BJ,AckermannMR,Wilhelmsen CL,Brown GB,Stevens MG，Whetstone CA.Molecular definition ofthe bovine granulocytopathy syndrome:identification of deficiency of theMac-1(CD11b/CD18)glycoprotein[J].Am J Vet Res,1990,51(11):1826-1836.），Taq

Ⅰ酶切后，根据RFLP图谱分为2个基因型，正常基因纯合子切成2条片段，杂合子切成3条片段。共检出3头母牛携带者，占母牛群的0.84%，在Holstein种公牛中没有发现隐性突变基因的携带者。Mukho等（Mukhopadhyaya P N,Mehta HH,Rathod R N.A method for the simulation of normal,carrier and affected controlsfor PCR-RFLP screening of a genetic disease in dairy cattle[J].Mol CellProbes,2000,14(6):381-384.）用PCR-RFLP法对CD18基因进行检测，检出结果与上述一致。应用PCR-RFLP技术，优点是价格便宜，技术简便，适用于少量样品的已知SNP（Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性）判断。缺点是费时费力，试验速度慢，灵敏性差，仅能检测有酶切位点的片段。