[发明专利]一种诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法。

背景技术

植物生物技术是一种重要和先进的技术，而组织培养则是生物技术的重要组成部分。由于大豆愈伤组织和叶片等的植株再生技术还没有确立，下胚轴成为唯一能够再生不定芽的外植体材料。但是，迄今为止下胚轴的不定芽再生效率一直不尽人意，不定芽的质量也较差，由此严重地影响了生物技术改良大豆品种的进程。

在以大豆下胚轴作为外植体诱导不定芽再生时，通常是在大豆种子萌发培养基或/和下胚轴外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，而最常用的细胞分裂素为苄基腺嘌呤（BA），浓度为1-3 mg/L。在这种条件下外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差。造成这种情况的原因首先是由于长时间培养外植体不能够用高浓度的细胞分裂素，因为长期高浓度激素培养外植体将导致外植体受伤甚至死亡，而低浓度的细胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不够强。其次是在不定芽形成以后残存在培养基和外植体组织中的细胞分裂素对不定芽的进一步生长有十分不利的影响。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术的缺陷，提供一种高效的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法。

本发明提供的方法包括如下具体步骤：

（1）将大豆幼苗在MSB5培养基上培养后，进行切割获取下胚轴外植体；

（2）对下胚轴外植体的形态学上端部分用苄基腺嘌呤（BA）溶液浸泡处理；

（3）将步骤（2）处理后的下胚轴外植体接种至MSB5培养基上培养。

优选地，步骤（1）和步骤（3）所述MSB5培养基中BA的浓度为0。不添加BA的萌发培养基上所获得下胚轴外植体再生效果最佳。

优选地，步骤（2）的浸泡处理时间为20-40 min，此时外植体的不定芽再生效果最好。

优选地，步骤（2）的苄基腺嘌呤溶液浓度为30mg/L，此浓度下能获得较高的不定芽再生率和单株芽数，并且再生的不定芽能够继续生长。

优选地，步骤（2）浸泡处理后清除残留在下胚轴外植体表面的苄基腺嘌呤溶液，以进一步减少对不定芽生长的影响。

步骤（2）的BA溶液采用一般方法配制成所需即可，具体地，可以采用如下方法配制：称取一定量的BA粉末，用1mol/L NaOH充分溶解，再用去离子水定容，配制成30mg/L的BA溶液；采用1mol/L HCl调整BA溶液的pH至5.8-6.0。

步骤（1）和步骤（2）的培养条件均为：室温为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时。

步骤（1）和步骤（3）的MSB5培养基中含有：MS培养基配方的无机成分、B5培养基配方的有机成分、25 g/L蔗糖、100 mg/L肌醇、300 mg/L蛋白胨、7 g/L琼脂，pH为5.8-6.0。具体来说，MS培养基配方的无机成分包括16.5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7 g/L磷酸二氢钾、3.7 g/L七水硫酸镁、4.4 g/L二水氯化钙、16.9 mg/L一水硫酸锰、8.6 mg/L七水硫酸锌、6.2 mg/L硼酸、0.83 mg/L碘化钾、0.25 mg/L二水硫酸钼二钠、0.025 mg/L五水硫酸铜、0.025 mg/L六水氯化钴、37.3 mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27.8 mg/L七水硫酸亚铁；B5培养基配方的有机成分包括10 mg/L盐酸硫胺素、1 mg/L盐酸吡哆醇、1 mg/L烟酸、100 mg/L肌醇。

本发明还提供一种合适的处理装置，用于方便地对下胚轴外植体进行短期激素处理，即用于步骤（2）的浸泡处理：采用一块通常用于核苷酸片段扩增的4 cm×6 cm PCR板，整齐的切掉PCR板底部的小管，保留四个角上的小管作支架，放在有盖的培养皿中。该装置可置于高压蒸汽灭菌锅中进行常规灭菌。

本发明对通常的大豆下胚轴外植体不定芽再生培养方法进行了创新，即在为获取下胚轴外植体的萌发培养基和诱导下胚轴不定芽的再生培养基中都不添加BA，取而代之的是利用高浓度的BA溶液对从幼苗取得的下胚轴外植体的上端切口附近进行短期的浸泡处理，给予外植体上端切口附近具有分化能力的细胞相对于普通添加BA的培养基更强的刺激，诱导形成更多的不定芽。同时，由于仅是局部短时的浸泡处理，BA在细胞中的浓度随后很快降低，减少了在培养后期对所形成的不定芽的发育的负面影响，也不会影响下胚轴外植体下端切口的不定根再生，可以达到一次培养操作就可以得到完整植株的高效目的。