[发明专利]一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品检验技术领域，涉及一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法及其在多杀性巴氏杆菌疫苗效力检验中的应用。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一类能引起多种畜禽、宠物、野生动物及人类感染的人畜共患病原菌。研究报道，该病原菌广泛流行于世界各地，无宿主特异性，可通过相互接触经呼吸道进行水平和垂直传播；Davies等2004年报道该菌甚至可以在不同的宿主间发生种间传播。在我国，引起畜禽巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清A型Pm，其次为荚膜血清D型Pm，引起牛巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清B型Pm，荚膜血清B型也能引起牛发生肺炎。

在抗生素耐药性日益严重的情况下，对巴氏杆菌病的控制更依赖于多杀性巴氏杆菌疫苗。到目前为止，我国已有禽、兔、猪和牛的多杀性巴氏杆菌灭活(或活)疫苗，均具有良好的临床效果，为畜禽巴氏杆菌病的控制起到了积极的作用。

但是，现有技术中，疫苗的效力检验均为免疫后强毒攻毒的方法，例如，《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)中关于猪多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制造及检验规程之效力检验。其一种方式是用体重1.5～2kg家兔4只，各皮下或肌肉注射疫苗2ml，21日后，连同条件相同的对照家兔2只，各皮下注射致死量的C44-1强毒菌液或C44-8强毒菌液(含活菌800～100个)，观察8日，对照兔全部死亡，免疫兔至少保护2只为合格。另一种方法是用体重15～30kg的健康易感猪5头，各皮下注射疫苗5ml，21日后，连同条件相同的对照猪3头，各皮下注射致死量的C44-1强毒菌液，观察10日，对照猪全部死亡，免疫猪至少保护4头；或对照猪死亡2头，免疫猪全部保护为合格。上述两种方法均存在费时费力、增加疫苗生产成本、强毒散毒的风险等问题。

间接血凝试验(IHA)于上世纪80年代开始应用于多杀性巴氏杆菌抗体的检测，例如，毛春生等人采用间接血凝试验检测鸡血清中多杀性巴氏杆菌抗体(毛春生，卢中华，崔保安等，中国兽医科技，1991，21(7)：29～31)。该方法先采用洗下血液琼脂平板上的融合生长培养物，置于56℃水浴中热浸30分钟，然后离心取上清来制取热浸荚膜抗原；采用上述方法洗下培养物，并于细菌悬液超声波击打6分钟，离心取上清来制取超声波粉碎抗原；然后，采用取自健康公绵羊的红细胞，按文献《兽医免疫学实验指导》的方法进行甲醛化、戊二醛化或甲醛一戊二醛双醛化，并分别以热浸荚膜抗原、超声粉碎抗原致敏之，致敏后以1∶10000浓度的酸靴化，以0.01mol pH6.4，1％血清的PBS洗3次，最后配成1％红细胞悬液，由此制得IHA抗原。该方法中致敏用抗原仍无参考标准，反应条件不一致。

因此，目前存在的问题是需要研究建立一种可用于多杀性巴氏杆菌疫苗效力检验的，操作简单，成本低廉，无强毒散毒的风险，敏感性及重复性好的稳定的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法及其在多杀性巴氏杆菌疫苗效力检验中的应用。该方法以多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中的多糖含量为依据，通过筛选间接血凝试验中抗原最佳稀释度，建立敏感性、重复性好的稳定的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法，采用该试验法检测疫苗免疫动物血清的间接血凝效价，探索血清间接血凝效价与免疫后强毒攻毒保护率之间的平行关系，并应用于多杀性巴氏杆菌疫苗的效力检验。

为此，本发明提供了一种多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的建立方法，包括：

步骤A：测定多杀性巴氏杆菌荚膜抗原中荚膜多糖的含量；

步骤B：使用不同荚膜多糖含量的多杀性巴氏杆菌荚膜抗原致敏绵羊红血球测定同一血清样品的IHA效价，并确定最高血清IHA效价所对应的荚膜多糖含量；

步骤C：基于最高血清IHA效价所对应的荚膜多糖含量确定间接血凝试验法中抗原稀释度，并建立多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法。

根据本发明，还包括在步骤A之前进行建立初级多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的步骤。

在本发明的一个实施例中，在建立初级多杀性巴氏杆菌间接血凝试验法的步骤中，其结果判定终点为100％凝集。间接血凝试验是在室温条件下反应60min或在37℃条件下反应30min。致敏用多杀性巴氏杆菌荚膜抗原，例如，优选为多杀性巴氏杆菌的热提取抗原。