[发明专利]一种木糖醇基因工程菌及其混合转化生产木糖醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种木糖醇基因工程菌的构建及其用于混合转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。

背景技术

木糖醇是一种五碳糖，其化学名称为 1,2,3,4,5—戊醇，分子式为C₅H₁₂O₅，是一种白色结晶或结晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系数等理化性质与蔗糖基本相同，可以作为蔗糖的替代品。木糖醇是一种具有较高营养价值的天然甜味物质，同时也是一种低能量甜味剂。木糖醇是人体糖类代谢的中间体，食用后不消耗胰岛素，并且木糖醇具有特殊的防龋功能，可作糖尿病人的营养剂、治疗剂及儿童防龋食品，同时木糖醇还具有降低血糖浓度、促进钙吸收等多种功能。

目前，木糖醇工业生产主要采用化学酸化催化加氢法和利用微生物直接发酵半纤维素水解液生产木糖醇，这两种方法的原料多来源于富含多缩戊糖的玉米芯、甘蔗渣等农副产品，这些原料首先经过高温水解后成为含大量木糖的水解液，因此存在酸碱消耗高、环境污染严重、工艺复杂等问题。全生物法制备木糖醇的研究已经引起了全球的关注，但是在自然界中还没有发现直接发酵葡萄糖生产木糖醇的微生物。1969年，Onishi和Suzuki首先报道了通过三步发酵将葡萄糖转化为木糖醇，首先利用 Osmophilic yeast将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇，再利用Acetic acid bacteria将生成的D-阿拉伯糖醇氧化成D-木酮糖，之后D-木酮糖被一种酵母还原为木糖醇，但是其转化率非常低，后续发酵过程复杂。

我们利用氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)将D-阿拉伯糖醇氧化还原为木糖醇，氧化葡糖杆菌购自中国微生物菌种保藏中心，编号：CGMCC1.110，该菌同时具有D-阿拉伯糖醇脱氢酶（AraDH）和木糖醇脱氢酶（XDH）活力，能够将D-阿拉伯糖醇大部分氧化为木酮糖，而XDH的活力相对较低，木糖醇的生成量就远远小于D-木酮糖的量，如果以木糖醇为目的产物，如何提高XDH的活力成为研究的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高木糖醇脱氢酶活力的基因工程菌大肠杆菌BL-xdh06  Escherichia coli BL-xdh06，已于2012年6月7日保藏于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO. M 2012207。

本发明的另一个目的是提供一种具有高转化率的混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。利用氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，按照下述步骤进行：

（1）挑取氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)斜面菌落于种子液培养基，28-37℃、100-260 rpm振荡培养8-20h。

（2）将种子液以体积比1-10 %的接种量接种到扩大培养基，28-37℃、100-260 rpm振荡培养48-96h。

（3）将（2）中的发酵液6000-12000 rpm，4℃离心5-20 min，收集菌泥，用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体；    

（4）转化液转化温度为28-37 ℃，100-260rpm振荡转化24-60h，4h取样，4h取样，转化液中得到木糖醇。

本发明的另一个目的是提供一种具有高转化率的混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。利用构建的基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇，D-阿拉伯糖醇的转化率由29 %提高到91.6 %。

利用上述构建的基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，按照下述步骤进行：

（1）挑取氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)斜面菌落于种子液培养基，28-37℃、100-260 rpm振荡培养8-20h。

（2）将种子液以体积比1-10 %的接种量接种到扩大培养基，28-37℃、100-260 rpm振荡培养48-96h。

（3）将（2）中的发酵液6000-12000 rpm，4℃离心5-20 min，收集菌泥，用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体；