[发明专利]敲除脯氨酸合成途径提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及工业微生物生产精氨酸的方法。更具体的，本发明涉及基因工程重组钝齿棒杆菌生产精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。

随着我国医药营养水平的提高，对精氨酸的需求日益增长，但传统生产L-精氨酸的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性；DNA重组技术出现以后，人们开始探索利用DNA重组技术调控合成精氨酸代谢途径，以达到提高精氨酸产量的目的。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是我国研究者分离到的一种钝齿状、无芽孢的革兰式阳性菌，其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。C.crenatum SYPW是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株的保藏编号为CCTCC NO：M208133)，SYPA 5-5是此菌株经过传代5次后得到的菌株，其菌株特性在传代中与SYPW保持一致。

对氨基酸生产菌株代谢途径及代谢网络进行有目的的改造从而提高氨基酸的产量是现代工业生物技术的一个主攻目标。对目标菌株进行遗传改造时，经常涉及到多个基因的连续敲除，利用枯草杆菌中sacB基因作为一个条件致死型标记，携带抗生素抗性与sacB双标记的新型整合型载体pK18mobsacB，对谷氨酸棒状杆菌染色体基因实现了多基因的无痕敲除及基因替代，促进了棒杆菌属的一系列菌株的遗传改造，为棒杆菌代谢工程改造提供了良好的遗传改造手段。

发明内容

本发明主要针对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基因进行敲除，以增强目标产物精氨酸合成途径关键酶基因簇表达的同时，削弱脯氨酸合成竞争支路途径的代谢流，最终使L-谷氨酸分解代谢集中在L-精氨酸的合成代谢流从而进一步提高精氨酸的产量。

通过对L-精氨酸合成代谢途径的分析，代谢工程改造L-精氨酸生产菌株的另一育种方案就是削弱葡萄糖→L-谷氨酸→L-精氨酸代谢相关竞争途径中的分支代谢流，使得更多的代谢流向合成L-精氨酸及其前体物L-谷氨酸。在钝齿棒杆菌L-精氨酸的合成代谢途径中，以葡萄糖为底物，经过TCA循环中的α-酮戊二酸合成L-谷氨酸，在基因簇argCH编码的7个酶的催化下合成L-精氨酸。而L-Glu除作为合成L-精氨酸的前体物，其代谢流还可以向L-脯氨酸和L-谷氨酰胺合成。对C.crenatum SYPA(相关菌株的保藏编号为CCTCC NO：M208133)发酵L-精氨酸来说，应削弱旁路代谢流量而集中葡萄糖经TCA循环中的α-酮戊二酸→L-谷氨酸→L-精氨酸的代谢流量，因此本发明将对L-精氨酸合成相关竞争途径——脯氨酸的合成进行敲除，根据模式菌株谷氨酸棒杆菌全基因组中proB基因(GenBank No.BA000036.3)设计钝齿棒杆菌中L-脯氨酸合成proB基因的敲除，从而提高了钝齿棒杆菌发酵产L-精氨酸的产量而完成了本发明，目前相关研究暂无报道。

技术方案如下：

(1)以钝齿棒杆菌基因组为模板，分别以proB基因上下游引物进行PCR扩增，其引物序列如下：

PproBF EcoRI 5’-CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGC

PproBR SalI 5’-CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC

PCR获得长为1,100bp的目标特异产物，经纯化后与pMD18-T连接，转化JM109，提取质粒，酶切验证并测序。

(2)设计引物利用重叠PCR的方法扩增缺少了300～500bp的缺失型基因proB’，引物序列如下：

PΔproB R5’-CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATC

P ΔproB F 5’-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT

经两轮重叠PCR获得核苷酸片段经琼脂糖凝胶电泳检测，图1所示为含同源片段proB’与理论大小一致，缺失片段构建成功；将目的片段proB’与pK18mobsacB线性化载体相连构建重组质粒，转化E.coli JM109，并挑取阳性转化子。