[发明专利]利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶

权利要求书

1.一种重组质粒pET-28a-saald，其特征是以Staphylococcus aureus基因组DNA为模板，扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-saald。

2.权利要求1所述的基因saald的扩增方法，其特征是基因的克隆根据saald基因的特异性设计引物，P1：5’-ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(EcoR I)；P2：5’-TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Not I)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：金黄色葡萄球菌染色体DNA 2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增saald基因，大小为705bp。

3.一种高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶的重组菌E.coliBL21/pET-28a-saald，其特征是构建方法如下：

(1)将含saald基因的重组质粒pET-28a-saald通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌BL21中，在含卡那霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌E.coliBL21/pET-28a-saald；

(2)对上述重组菌进行诱导表达，超声波破碎后测定ALDC的酶活力，并与对照菌株进行比较，重组菌E.coli BL21/pET-28a-saald的酶活力相对较高，经测定其粗酶的比酶活可达56U/mg。

4.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于该菌高效表达的α-乙酰乳酸脱羧酶具有如下酶学性质，该酶的最适反应pH为6.0；反应最适温度为45℃，在35℃以下酶的稳定性较好；Sn²⁺、Zn²⁺对ALDC有明显的抑制作用，其中Zn²⁺和Fe³⁺的添加几乎使酶完全失去活性，而Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺和EDTA对酶的影响非常小，没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子；酶动力学参数以α-乙酰乳酸为底物的Km值为0.0177mmol/L，Vmax为2.06μmol/(mL/min)。