[发明专利]利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶

说明书

技术领域

利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶属于基因工程和酶工程领域。 

背景技术

α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，简称为ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，它可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，对啤酒工业来说极有经济价值。 

α-乙酰乳酸脱羧酶主要应用于啤酒酿造工业。在啤酒酵母代谢过程中，α-乙酰乳酸是亮氨酸一缬氨酸生物合成过程的中间产物。大部分α-乙酰乳酸在酵母细胞内代谢形成缬氨酸和亮氨酸，小部分渗漏到细胞外，进入发酵液中，在胞外经非酶氧化生成双乙酰。在啤酒酿造过程中，双乙酰是影响啤酒质量的关键因素，也是决定啤酒成熟与否的重要指标，虽然双乙酰赋予了啤酒特殊的风味，但是其口味阈值比较低(0.02～0.10mg/L)，当含量超过0.15mg/L时就会给啤酒带来不愉快的馊饭味，因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要的。α-乙酰乳酸脱羧酶能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸迅速分解为乙偶姻，从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量。 

酿酒酵母不含ALDC，很多细菌中含有该酶。Godtfredsen等测试的34个属79个种(325株)细菌中，有ALDC活性的占20个属40个种。α-乙酰乳酸脱羧酶首次于1952年从产气肠杆菌中分离得到，之后有关该酶在生物界中的分布及菌种选育得到了广泛研究。a-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)存在于多种细菌中，它参与α-乙酰乳酸代谢，将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻。目前还未在真菌、海藻和原生动物等真核生物中发现该酶的存在。 

细菌中天然存在的ALDC产量很低，要想将该酶应用于啤酒工业，研究ALDC的分子结构以及ALDC基因，进行基因的克隆和表达，提高酶的产量，是一种必然的选择。随着对ALDC分子水平研究的深入，α-乙酰乳酸脱羧酶基因已经从多种细菌中克隆得到，并在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母中获得了不同程度的表达。 

发明内容

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自金黄色葡萄球菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因在本发明中简称saald，构建重组表达载体pET-28a(+)-saald，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-saald/BL21，利用亲和层析法对表达的ALDC进行了纯化，得到了酶活可达到469.85U/mg的纯酶液，并对该酶的酶学性质进行了研究，以便为以后该酶的应用提供理论基础。将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中，初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。 

本发明的技术方案： 

1.α-乙酰乳酸脱羧酶引物设计 

根据NCBI金黄色葡萄球菌的全基因组核酸序列中saald基因序列，设计α-乙酰乳酸脱羧酶的PCR引物P1和P2。 

P1：5’-ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(EcoR I) 

P2：5’-TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Not I) 

2.重组菌的构建 

从金黄色葡萄球菌中抽提染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用下共同的限制性内切酶对载体pET-28a和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接。取连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞进行转化，挑取阳性转化子于10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。 

3.重组菌α-乙酰乳酸脱羧酶的表达纯化 

取冻管保藏的菌种接入10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日转接，诱导表达，将诱导液通过亲和层析纯化得到纯酶液。粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。经测定粗酶液比酶活是56U/mg，纯酶液比酶活是469.85U/mg。纯酶液进行酶学性质的初步研究。 

4.α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的应用