[发明专利]一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传学领域，公开了一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法。

背景技术

种子纯度是农业生产中最重要的问题之一，它关系到国家粮食安全，是种子产业化开发中最重要、最核心的内容，因而也关系种子企业生死存亡。大部分农作物种子纯度要求都在95%以上，甚至为99.9%（表1），因而，需要大量统计抽样才能获得准确数据，工作量十分巨大。例如合格的杂交稻品种纯度要求达到96%，则意味着100个植株最多只允许4个杂株，那么要使检测结果可靠，至少应该检测500粒种子，工作量是巨大的。另外，由于技术缺陷，各种种子纯度检测方法还存在受环境影响、速度慢、费用高等问题，影响到了鉴定的准确性、种子及时上市、成本等重要问题。

表1农作物种子纯度标准（GB4404.1-2008）

种子纯度检测经历了从田间表型鉴定到实验室分子标记鉴定的发展。田间表型鉴定的操作过程是这样的：从生产的种子中随机抽取一定数量的种子，田间种植并观察性状，通过与品种的真实性状比较，鉴定出杂株。例如，由100个植株构成的鉴定群体中，发现2株株高和3株颜色明显不同于该品种真实性状的植株，则该品种的纯度为（2+3）/100=95%。田间鉴定的缺陷是明显的：一是需要种植一个季节，周期长、占地多、费用高，而种子从生产到销售的时间只有2-3个月时间，田间鉴定周期严重影响了种子销售上市。二是植株性状常受环境影响，如在高肥力条件下，植株更高大，从而误判为杂株，使鉴定结果不准确。分子标记鉴定种子纯度在很大程度上克服了以上问题，其理论依据可以简单描述为：利用杂株与品种间特定分子的不同，鉴定杂株，计算种子纯度。依据分子标记的类型不同，可分为蛋白质（如同工酶等）和DNA分子标记鉴定。蛋白质分子标记鉴定也有明显的缺陷，一是蛋白表达同样受环境影响，使鉴定结果不准确；二是可用于鉴定的蛋白分子标记不多，使这种技术难以用于区分亲缘关系较近的品种。DNA分子标记是根据杂株与正常品种在DNA水平上的序列差异进行鉴定的，该技术在很大程度上克服了以上几种鉴定方法的不足。首先，DNA序列差异不再依赖于环境，因此，鉴定结果是准确的；第二，从理论上讲，任何杂株与正常品种DNA都存在差异，因此，可用于鉴定任意品种；第三，由于种子、幼苗、成株期的DNA都是一样的，因此，鉴定不再需要田间种子，只需要室内简单发芽提取DNA即可，缩短了检测周期，为种子推广赢得了时间。然而，企业可能需要检测多个生产地点或生产者的种子是否合格，检测工作量巨大，即使是利用DNA分子标记检测，常常也会由于工作量大而无法及时完成检测，同时，巨大的工作量也伴随着检测成本过高的问题。例如，国家法律规定，杂交水稻种子的纯度不得低于96%，因此，若要求在95%的概率保证下，种子纯度误差不超过1%，则每个样本需要抽检3000粒种子才能达到要求，若检测100个样本，则需要提取DNA、PCR、电泳分别为3000*100=30万次。在检测人员和设备有限的情况下，几乎是不可能在在种子包装与销售前完成检测工作，严重影响上市。在此情况下，只能减少抽样量，以达到减少工作量的目的。例如，一般企业抽检100粒种子，在此情况下，若依旧要求纯度误差不过1%，那么对结果的把握度（概率保证）仅为15%左右。所以，即使得到了检测结果，并没有把握判断该批次的种子是否合格，给市场销售带来巨大风险。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够准确、快速检测杂交种子纯度的方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，包括以下步骤：根据种子纯度要求，计算抽样样本量；等量抽样并混合提取DNA或分别提取DNA后再等量混合；按检测位点的碱基序列，设计PCR引物扩增检测位点；回收并纯化PCR扩增产物；利用扩增产物建库并进行高通量测序；根据检测位点序列比例，计算种子纯度。

本发明提供更优选的技术方案是：一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，包括以下步骤：

（1）计算最小抽样样本量：根据商品种子纯度要求、设定的概率保障和允许的误差，确定最小的样本抽样量；

（2）DNA提取：对每一植株，选取相同部位的等量材料混合后提取DNA；或者，提取每一植株的DNA，再对DNA进行定量抽取后再等量混合；