[发明专利]用于试样的图像显示方法及其光学显微设备有效
申请号: | 201210212564.2 | 申请日: | 2012-06-21 |
公开(公告)号: | CN102841079B | 公开(公告)日: | 2017-03-01 |
发明(设计)人: | J·弗林格 | 申请(专利权)人: | 徕卡显微系统复合显微镜有限公司 |
主分类号: | G01N21/64 | 分类号: | G01N21/64;G02B21/36 |
代理公司: | 北京泛华伟业知识产权代理有限公司11280 | 代理人: | 王勇,王博 |
地址: | 德国韦*** | 国省代码: | 暂无信息 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 试样 图像 显示 方法 及其 光学 显微 设备 | ||
技术领域
本发明涉及一种应用权利要求1的前序部分的光学显微设备以进行试样图像显示的方法。本发明还涉及一种根据权利要求9的前序部分的光学显微镜设备。
背景技术
近来研发了光学显微成像方法,通过所述方法,试样能够基于单一标记物,特别是荧光分子的有序的、随机的定位而被显示,所述试样比常规的光学显微镜的基于衍射的分辨极限更小。例如在文献WO2006/127692A2;DE102006021317 B3;WO2007/12843 A1;US2009/0134342 A1;DE102008024568 A1;“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscope(STORM)”,Nature Methods 3,793-796(2006),M.J.Rust,M.Bates,X.Zhuang;“Resolution of Lambda/10in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching”,Geisler C.et al,Appl,Phys.A,88,223-226(2007)中描述了这类方法。这种新的显微术分支也称为定位显微术。在文献中,所述应用的方法以如下标记被公开,例如:(F)PALM((Fluorescence)Photoactivation Localization Microscopy(荧光)光敏定位显微镜),PALMIRA(PALM with Independently Running Acquisition具独立运行采集器的PALM),GSD(IM)(Ground State Depletion Individual Molecule return)Microscopy基态损耗(单分子返回)显微镜)或(F)STORM((Fluorescence)Stochastic Optical Reconstruction Microscopy(荧光)随机光重建显微镜)。
这类新方法的共同点在于利用标记物处理待成像的试样,所述标记物具有两种状态,即“亮”态和“暗”态。例如当使用荧光染料作为标记物时,则亮态是能发荧光的状态,而暗态是不能发荧光的状态。为了以比成像光学系统的常规分辨极限更高的分辨率对试样进行成像,就要使小部分量的标记物重复转变成亮态。该“活性”的部分量形成标记物结构,其各个转变成亮态的标记物相互之间的平均间距大于成像光学系统的分辨极限。该各标记物结构在空间分辨图像传感器上成像,该图像传感器以检测在空间上相互可分开的光分布的形式来检测该各标记物。
以此方法摄取大量单一图像,在这些单一图像中总是成像有另一种标记物结构。在图像分析过程中由此确定每个单一图像中所述光分布的重心位置,该重心位置显示了处于亮态的标记物。将由原始数据-单一图像测算出的光分布的重心位置以全图形式汇总到总图示中。通过该总图示产生的高分辨率的全图反映出标记物的分布。
为了有代表性地重现该待测试样,必须探测到足够多的标记物信号。但是,因为在各活性标记物结构中标记物的数目被处于亮态的两标记物相互间所必需的最小平均间距所限,所以需摄取非常多的单一图像,以使该试样充分成像。通常单一图像的数目为10000-100000。
摄取单一图像所需的时间的下限被该图像传感器的最大图像摄取速率所限。这导致了用于总图示所需的单一图像序列的总摄取时间相对较长。因此所述总摄取时间可达数小时。
在这样长的总摄取时间内,会产生导致待成像试样相对于成像光学系统发生偏移的热效应,例如光显微镜机械部件的热膨胀、收缩或应变。由于为了完成高分辨率的全图而按重心规定汇总所有的单一图像,所以在摄取两个相继的单一图像时出现的试样和成像光学系统之间的所有相对移动均恶化该全图的位置分辨率。
上述的问题可在下面按附图1至4阐明。
图1示出常规的倒置光学显微镜10的简图。该倒置光学显微镜10具有支架12,其上安置有载物台14。在载物台14上安置试样固定件15,待成像的试样16布置在所述试样固定件上。
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