[发明专利]用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用。

背景技术

野生稻在植物分类学上隶属于单子叶植物纲、禾本目、禾本科，野生稻为禾本科稻属野生种的泛称，1973年，被誉为“杂交稻之父”的中国著名水稻专家袁隆平利用在海南发现的一株野生稻，成功培育出杂交水稻，掀起了水稻生产的“第二次绿色革命”。中国野生稻资源是中国稻种资源的重要组成部分,作为栽培稻的野生亲缘种，具有栽培稻中缺少或已消失的优异基因，如抗寒性、抗病虫性、抗逆、雄性不育种质、恢复种质等构成了水稻遗传改良的重要基因源。然而近年来，随着经济的发展，人类活动严重干扰和破坏了野生稻的生存环境，加上物种流失的加剧，使野生稻处于严重的濒危状态和灭绝的边缘，所以保护和鉴定野生稻尤为重要。在20多个野生稻种中，我国只分布有三种野生稻即普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)，药用野生稻（Oryza officinalis Wall.ex Watt.）和疣粒野生稻（Oryza granulata Nees et Arn.ex Watt.）。其中疣粒野生稻被定为国家二级保护植物，列入中国植物红皮书。鉴于目前还没有关于疣粒野生稻鉴定技术方面的报道，因此建立疣粒野生稻的查验技术方法以便于口岸查验应用，以及对于防止我国重要物种资源流失等方面具有十分重要的意义。

近年来，以DNA为基础的分子标记技术如RFLP、RAPD、SSR、AFLP等在稻属植物的系统关系研究中被广泛应用，但是对于确立稻属植物种间系统关系，DNA标记所提供的信息位点有限。植物细胞中存在3套基因组：核基因组（nDNA）、叶绿体基因组（cpDNA）和线粒体基因组(mtDNA)，因其结构和功能上的差异,进化速率也有所不同，在植物系统发育重建中，来自叶绿体基因组的DNA片段和来自核基因编码核糖体的DNA片段是两个最主要的分子证据来源，线粒体基因组的进化速率慢且在植物不同种间的基因组结构和基因排序变异非常大，在系统发育研究中应用有限。

单拷贝核基因(single-copy nuclear gene)是指基因组中拷贝数目少,只有1个或几个拷贝的核基因,多数是生物体内组成型表达的持家基因，具有中等程度的进化速率和适合系统发育分析的基因结构，在许多植物类群的研究中，单拷贝核基因相比含有更多的信息位点，具有更大的潜力来重建系统发育。磷酸丙糖异构酶(Triose phosphate isomerase,TPI)是糖酵解过程中催化二羟丙酮磷酸与3-磷酸甘油醛之间可逆反应的一种异构酶，其催化功能高度保守，其基因分子结构在生物的长期进化中未发生大的改变，可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要指标。近年来，有研究发现水稻胞质TPI是单拷贝基因，且为直系同源基因（orthologs，也称直向同源和垂直同源），该基因的进化史可以反映物种的进化。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用。

本发明通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列进行扩增和测序，分析其系统进化关系及序列差异，得到用于鉴定疣粒野生稻（O.granulata）的特异性分子标记。序列分析表明，栽培稻间TPI基因序列碱基变异少，野生稻相对变异丰富，其中疣粒野生稻变异尤为明显，根据疣粒野生稻的TPI基因序列特异位点设计引物，利用该特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的准确鉴定。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记，其位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供用于鉴定疣粒野生稻的特异性PCR引物，包括正向引物 F5'-CAGTGGTGGAGCCAGAAATT-3' 和反向引物R5'-GCTTAATCAGGGGCAGAGGC-3'。

本发明还提供所述特异性分子标记在鉴定疣粒野生稻中的应用，其包括步骤：1）提取待测植株的基因组DNA；2）以待测植株的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应；3）检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的产物，则待测植株为疣粒野生稻。