[发明专利]定点突变和定点修饰的病毒膜蛋白、其制备方法及其应用

权利要求书

1.定点突变的水泡性口炎病毒的VSV G蛋白，其在特定位点的1个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为

所示的DiZPK；

所述特定位点选自：示于SEQ ID NO：1的序列的第I37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位中的1个位点。

2.定点突变的VSV G蛋白，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-diazirine，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：

由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第I37位，Q42位，D121位，K172位，Y174位，D185位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，P362位，位氨基酸中的一个，

R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，

R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R3为

3.定点突变的VSV G蛋白，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为DiZPK，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：

由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第N20位，Y77位，Y116位，V161位氨基酸中的一个，

R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，

R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R4为

4.编码突变的VSV G蛋白的核酸分子，所述核酸分子与编码SEQID NO：1的核酸分子SEQ ID NO：2的区别在于，其中编码SEQ IDＮO：1的第I37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

5.核酸载体，其可操作地连接有权利要求5的核酸分子。

6.权利要求5的核酸载体，其还可操作地连接有标签序列。

7.权利要求6的核酸载体，其中的标签序列是Flag标签序列。

8.宿主细胞，其中含有权利要求5－7中任一项的核酸载体。

9.权利要求8的宿主细胞，其中还含有表达甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的质粒。

10.权利要求8或9的宿主细胞，其为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

11.定点修饰VSV G蛋白的方法，包括步骤：

（1）选择步骤：在VSV G蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；

（2）基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的VSV G蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；

（3）表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的VSV G蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；

（4）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒，

（5）表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有DiZPK的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；

（6）对于能够表达突变蛋白的宿主，对表达产物进行VSV G蛋白活性检测，保留野生型VSV G蛋白80％以上活性的突变体设定为定点修饰候选物