[发明专利]可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白的检测技术领域，尤其涉及一种蛋白检测用核酸适体、该核酸适体的筛选方法和应用。

背景技术

肌红蛋白（Myo）是存在于哺乳动物肌红组织中的一种氧集合蛋白，由153个氨基酸残基组成，含有血红素，和血红蛋白同源。在正常情况下以微量形式（男性：20～80 μg/L；女性：10～70 μg/L）存在于健康人血清中。当肌肉损伤时，大量的肌红蛋白便会进入到血液中，导致其在血液中的含量急剧上升。心肌肌红蛋白目前已作为早期诊断心肌梗死的标志物。近年来，肌红蛋白和心肌梗死的关系日益受到人们重视。目前，检测肌红蛋白最常规的方法还是利用肌红蛋白的抗原抗体反应。然而，现在基于抗体的检测技术依然存在着一定的局限性。因此，设计一种高亲和力和高特异性的识别肌红蛋白的核酸分子探针为之后优化其检测技术，避免抗体反应所致局限提供了基础。

核酸适体（aptamer），也称为核酸识体或核酸适配子，是经过一种新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选得到的，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸，可以是DNA也可以是RNA，长度一般为25～60个核苷酸。核酸适体探针的出现，打破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，利用核酸结构的多样性，可使核酸适体探针高效、特异地结合各种靶分子。由于核酸适体探针具有易合成、易修饰、易存储等优点，在蛋白质的分析检测、生物传感器、分子开关的开发、医学诊断治疗等方面有很大的应用前景，这也为肌红蛋白的具体检测应用提供了前提和基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有高亲和力和高特异性的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，还提供一种基于正反筛集成的微流控芯片及用该芯片筛选前述核酸适体的筛选方法，还提供利用该核酸适体进行肌红蛋白检测的具体应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列1～序列5中的任意一条序列所示的DNA片段，序列1～序列5被分别命名为Myo40-7-23、Myo40-7-27、Myo40-7-34、Myo40-7-69和Myo19-7-34：

序列1 Myo40-7-23：

5’- GACATCTATCGCCTCGATTTCCTTTGGTGAGATCGGCTCC-3’；

序列2 Myo40-7-27：

5’- CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3’；

序列3 Myo40-7-34：

5’- ACGCACAATTCCTTGTCCAATTAGGAAATTCTACGCGGAT-3’；

序列4 Myo40-7-69：

5’- CGAGTACTTCTTTGCTAGTTCGCGAGATACGTTGGCTAGG-3’；

序列5 Myo19-7-34：

5’ - TTCCTTGTCCAATTAGGAA-3’。

上述的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

上述的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上可结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种：

（1）将上述核酸适体任意位置上的碱基A、T、G或C置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；

（2）上述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； 

（3）上述核酸适体改造成的肽核酸；

（4）上述核酸适体改造成的锁核酸。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于筛选核酸适体的微流控芯片，所述微流控芯片包括进样口、出样口和连接二者的进样流道，所述进样流道上设有两个收缩段以形成两个狭窄流道，两个收缩段将进样流道分隔成前流道、中流道、后流道三个流段，所述前流道中填充至少上千个表面修饰有反筛蛋白的反筛蛋白修饰微珠以形成反筛单元，所述中流道中填充至少上千个表面修饰有正筛蛋白的正筛蛋白修饰微珠以形成正筛单元，所述反筛蛋白修饰微珠的粒径大于连通所述前流道和中流道的狭窄流道的宽度，所述正筛蛋白修饰微珠的粒径大于连通所述中流道和后流道的狭窄流道的宽度。