[发明专利]一种可保持活性的蛋白质顺序提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于蛋白质活性检测及功能蛋白质组学研究的蛋白质提取方法，具体地说是一种基于多种非变性溶剂的顺序提取方法的构建。

背景技术

功能蛋白质组学研究是一个重要的研究方向，它是在生命体或细胞的整体水平上研究蛋白质的表达和修饰状态，重点研究那些可能涉及特定功能机制的蛋白质群。鹿茸作为哺乳动物唯一能够完整持续再生的器官，在较短时时期内可以产生大量的血管、神经、软骨等组织，被认为是研究组织生长调节机制的理想模型。以鹿茸为样品，建立可以保持活性的提取方法，并对提取得到的活性蛋白质进行功能蛋白质组学分析，对于认识鹿茸生长过程中发挥调节作用的功能蛋白质群，进而推动我国传统动物药的深入开发有积极意义。

在功能蛋白质研究中，如何在保持活性的条件下对蛋白质进行广泛的提取是需要解决的重要问题。在此过程能否全面地获得样品中含有的蛋白质并保持其活性，对于后续蛋白质分离纯化和活性筛选至关重要。由国内外的研究现状可知，目前可保持活性的蛋白质提取方法相对简单，通常只采用单一溶剂提取。例如，稀盐和缓冲盐溶液（pH值近中性）常被用于提取水溶性蛋白质；酸溶液对碱性蛋白质的提取效果较好，碱溶液对酸性蛋白质有较好的提取效果；丁醇和非离子型表面活性剂常用于提取提取疏水性蛋白质。我们知道，在提取过程中，所用溶剂的种类越多，得到的蛋白质成分就会越多。若采用多种溶剂顺序提取，就可以较全面的提取蛋白质。有研究表明，在对组织样品进行蛋白质组学研究时，采用顺序提取法可以大大提高鉴定的蛋白质数量，这是由于多种溶剂具有较好的互补性。不仅如此，我们在研究中还发现，采用顺序提取法对鹿茸蛋白质进行提取时，获得的多个组分具有明显不同的活性，提示顺序提取法在一定程度上具有样品预分级的功能。这是由于各种溶剂的选择性不同造成的。因此，选择生物相容性良好的溶剂，发展顺序提取方法，实现生物样品中蛋白质的广泛提取，对于功能蛋白质组学研究具有较大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性蛋白质顺序提取方法，以期解决单一溶剂不能充分提取功能蛋白质的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

根据离子强度、酸碱性和极性方面的差异，选择多种性质不同的非变性溶剂，对液氮研磨粉碎的样品粉末依次进行提前，获得多种活性蛋白质组分。将所得组分经超滤处理，浓缩、除盐的同时，获得分子量大于5000Da的蛋白质组分。

具体为：

1）样品的前处理

取新鲜动物组织样品，用生理盐水清洗，去除血液残留。切成2×2×2mm的颗粒，在液氮条件下进行研磨，得到动物组织粗粉（粒径在0.1-1mm）。

2）顺序提取过程

首先向粗粉中加入盐溶液（含有蛋白酶抑制剂），1g粗粉中加入盐溶液为4-10ml，超声处理40S，每10S间隔10S。然后冰上孵育30min。将所得匀浆液于10000-20000r/min条件下离心5-40min，取上清液，得提取液备用。重复提取2次，合并上清液作为提取物A。向残渣中加入酸性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分B。向残渣中加入碱性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分C。向残渣中加入疏水性溶剂4-10ml（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分D。

3）活性蛋白质浓缩

将各提取液置于超滤离心管中（截留分子量为5000），在500-5000r/min范围内离心30min-6h。将过滤得到的除盐的浓缩液，冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存，待用。

本发明的优点为：(1)多种提取溶剂可以较广泛的提取蛋白质；(2)顺序提取过程可以实现初步分级效果。

附图说明

图1顺序提取法获得各组分的蛋白质组学分析结果；

图2顺序提取法获得各组分的活性考察结果；

具体实施方式

将采收的动物组织经真空泵抽净残留的鹿血，用生理盐水清洗，去除血液残留。切成2×2×2mm的颗粒，在液氮条件下进行研磨，得到动物组织粗粉（粒径在0.1-1mm）。