[发明专利]一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法

权利要求书

1.一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

鼻粘膜细胞的获取：将鼻粘膜刮匙的勺状末端伸入鼻腔至下鼻甲的中下端，将所

述刮匙轻轻按压在粘膜表面，然后向外移动4-5mm，重复此动作2-3次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物，获得鼻粘膜标本；

2） 单细胞悬液的制备：将所述鼻粘膜标本置于生理盐水中，轻轻吹打，使细胞分散混匀得到单细胞悬液；

3） 调节性T淋巴细胞检测：采用流式细胞术分析所述单细胞悬液的T淋巴细胞。

2.如权利要求1所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述

鼻粘膜细胞的获取步骤包括：将所述刮匙在粘膜表面向外移动5mm，重复此动作2次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物。

3.如权利要求1所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述

鼻粘膜细胞的获取步骤中所述下鼻甲的中下端为下鼻甲前部中下端1cm²范围。

4.如权利要求1所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述

鼻粘膜细胞的获取步骤中轻轻按压为使鼻粘膜下陷1mm-2mm，以此得到鼻粘膜细胞，而又不会导致鼻粘膜出血。

5.如权利要求1所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述单细胞悬液的制备步骤包括：将所述鼻粘膜标本置于1ml 生理盐水中，用移液器轻轻吹打，使细胞均匀分散，5000rpm离心10分钟，弃上清后，沉淀用200ul PBS重悬后得到单细胞悬液。

6.如权利要求1所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述

调节性T淋巴细胞检测步骤包括：

   1）  表面染色：加100ul所述细胞于12×75mm流式管中，并加入细胞表面染色抗体；

同型对照管：CD3-PerCP 5ul + CD4-APC 2ul + IgG1-FITC， 

试验管：CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC，涡旋两管，室温避光；

   2）  洗细胞：加PBS，离心，250g×10分钟，弃上清；

   3）  固定细胞：用残液轻轻重悬细胞，加2ml 1×人Foxp3反应缓冲液A，涡旋，室温避光，10分钟；

   4）  洗细胞：加PBS，离心，500g×5分钟，弃上清；

   5）  破膜：用残液轻轻重悬细胞，加0.5ml 1×人Foxp3反应缓冲液C的工作液，涡旋，室温避光；

   6）  洗细胞：加PBS，离心，500g×5分钟，弃上清；

   7）  Foxp3染色：同型对照管加入IgG1-PE 5ul；试验管加入Foxp3- PE 5ul，轻摇或涡旋，室温避光，30-60分钟，重复洗涤步骤7；

   8）  加300ul PBS，立即上机检测。

7.如权利要求6所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述

调节性T淋巴细胞检测步骤包括：

   1）  表面染色：加100ul所述细胞于12×75mm流式管中，并加入细胞表面染色抗体；

同型对照管：CD3-PerCP 5ul + CD4-APC 2ul + IgG1-FITC 5ul

试验管：CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC 5ul，涡旋两管，室温避光，20分钟；

   2）  洗细胞：加2ml PBS，离心，250g×10分钟，弃上清；

   3）  固定细胞：用残液轻轻重悬细胞，加2ml 1×Human Foxp3 Buffer A，涡旋，室温避光，10分钟；

   4）  洗细胞：离心，500g×5分钟，弃上清；

   5）  破膜：用残液轻轻重悬细胞，加0.5ml 1×Working Solution Human Foxp3 Buffer C，涡旋，室温避光，30分钟；

   6）  洗细胞：加2ml PBS，离心，500g×5分钟，弃上清，重复洗涤步骤1次；

   7）  Foxp3染色：同型对照管加入IgG1-PE 5ul；试验管加入Foxp3- PE 5ul，轻摇或涡旋，室温避光，30分钟，重复洗涤步骤7；

   8）  加300ul PBS，立即上机检测。