[发明专利]一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及细胞免疫学，更具体地，本发明涉及一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法。

背景技术

鼻粘膜是上呼吸道粘膜的一部分，是吸入性抗原、毒素和微生物等与机体免疫系统相互作用的第一战场。鼻粘膜的防御机制受体液和细胞免疫应答调控，涉及包括T、B淋巴细胞在内的免疫活性细胞。变应性鼻炎(AR) 正是由环境抗原如尘螨、植物花粉和动物蛋白等刺激导致的一组以鼻腔局部Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)优势表达、嗜酸性粒细胞选择性浸润、黏膜高反应和IgE过度合成为特征的疾病。其中调节性T淋巴细胞（T regulatory cell, Treg）的减少促进了Th2型免疫应答。Treg细胞是一种自然发生的、胸腺来源的CD4+CD25+Treg细胞，能够表达高水平的叉头状／螺旋状转录因子Foxp3(forkhead transcription factor p3，Foxp3)，其对CD4+CD25+Treg细胞的发育和功能至关重要。AR患者外周血单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+细胞的比率低于正常人，同时鼻粘膜Foxp3的表达降低，表明Treg细胞功能减弱。

对鼻粘膜淋巴细胞的认识十分有限，主要是由于组织来源困难和细胞数量有限，目前鼻粘膜组织的标本来自于经下鼻甲切除术获取的组织，研究的方法有三种：

1. 将组织制备成石蜡或冰冻切片，再经免疫组织化学染色法或免疫荧光法观察并计数CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。但由于Treg细胞数量极少，通常在一个200倍显微镜观察视野下仅能计数0-1个。

2.将组织匀浆后提取RNA，用RT-PCR的方法检测Foxp3的表达。此仅为间接检测法，不能直接反应Treg细胞的数量及Foxp3蛋白的表达。

3.组织经胶原蛋白酶消化后获取单个细胞，再采用流式细胞术检测Treg细胞的表达，可以通过检测大量的细胞对Treg细胞进行分析，但技术步骤繁琐，需要先将组织切成2mm³大小，预消化液37℃消化30min，离心后再经胶原蛋白酶消化60min后过滤细胞等步骤。

现有技术中存在以下缺陷：

1.由于获得的是下鼻甲组织块，除鼻粘膜组织外还含有较多的鼻粘膜下结缔组织，

需要对其进行多次消化，才能获得单细胞悬液，并且消化过程对细胞表面和胞内抗原的数量和功能的影响不可预知。

2.上述方法通过下鼻甲切除术获取鼻粘膜组织，需要全身或局部麻醉后施行手术，

局部有出血、创伤、术后鼻腔填塞，并且无法取到正常人的鼻粘膜标本。

3. 现有技术采用免疫组织化学染色法或免疫荧光法观察的细胞数量非常有限，通常

在一个200倍显微镜观察视野下仅能计数0-1个。现有技术采用RT-PCR的方法检测Foxp3基因的表达，仅为间接检测法，不能直接反应Treg细胞的数量及Foxp3蛋白的表达。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其采用对受试者无创的方法得到足够的鼻粘膜细胞，快速分析T淋巴细胞。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其包括如下步骤：

1）鼻粘膜细胞的获取：将鼻粘膜刮匙的勺状末端伸入鼻腔至下鼻甲的中下端，将所

述刮匙轻轻按压在粘膜表面，然后向外移动4-5mm，重复此动作2-3次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物，获得鼻粘膜标本；

2）单细胞悬液的制备：将所述鼻粘膜标本置于生理盐水中，轻轻吹打，使细胞分散混匀得到单细胞悬液；

3）调节性T淋巴细胞检测：采用流式细胞术分析所述单细胞悬液的T淋巴细胞。

本发明的另一方面，所述鼻粘膜细胞的获取步骤包括：所述鼻粘膜细胞的获取步骤包括：将所述刮匙在粘膜表面向外移动5mm，重复此动作2次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物。

本发明的另一方面，所述鼻粘膜细胞的获取步骤中所述下鼻甲的中下端为下鼻甲前部中下端1cm²范围。

本发明的另一方面，所述鼻粘膜细胞的获取步骤中轻轻按压为使鼻粘膜下陷1mm-2mm，以此得到鼻粘膜细胞，而又不会导致鼻粘膜出血。