[发明专利]基于阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺

说明书

技术领域

本工艺属于生物医药的分离纯化，以及中药制成药精制等领域，具体涉及一种基于新型阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺。

背景技术

水蛭素(hirudin)是存在于吸血水蛭（蚂蝗）的唾液腺中的一种蛋白质，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。1984年，Haycraft发现水蛭提取物有抗凝血作用。1904年Jocoby首次从医用水蛭中分离得到这种活性组分，并命名为水蛭素。1955年，Markwardt成功的从医用水蛭头部分离纯化出纯品水蛭素，开始进行基础的生物化学和药理学研究，并于1970年确定水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂。1986年，Harvey等得到水蛭素的cDNA，随后水蛭素基因在多种宿主中表达成功。天然水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽，其作用有以下几个方面：1.具有抗凝血作用。不同来源和结构的水蛭素，其抗凝血机制不尽相同。2.抗凝血酶作用。水蛭素的抗凝血酶作用见于欧洲医用水蛭素（hiNmedic5nalix）L1j、亚洲水蛭素（菲牛蛭）、和印度水蛭等。水蛭素对凝血酶的作用分两步进行，首先使凝血酶带正电荷的非催化位点部分与水蛭素的带负电荷的极性C-端部分产生静电作用形成初始结合体，随后该结合体通过控制扩散迅速重排，形成同凝血酶活性位点紧密结合的复合物。在该复合物中，水蛙素的C-端结合在凝血酶的纤维蛋白原识别位点，抑制凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，N-端则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。3.抗血小板作用。1992年，Como等从墨西哥水蛭中提取出一种称为菲牛蛭抗血小板蛋白质，具有特异性抑制胶原又到血小板聚集的作用，而对其他诱导剂（如血、凝血酶等）诱导血小板聚集无抑制作用。4.降解纤维蛋白（原）作用。1984年，Malin-conlco等从亚马逊巨型水蛭中提取一种称为hementin的物质。这种物质可以降解纤维蛋白（原）的特定肋链，具有抗凝血酶活性并能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。

水蛭素还是一种非常稳定的蛋白质，在干燥状态下极其稳定，单纯的温度升高(100℃水浴)或pH值的改变 (l.47-12.9)都不影响其活力，在某些变性剂存在的情况下也非常稳定，只有当温度和PH值同时升高时其活力才开始下降。一般室温下水蛭素在水中能稳定存在6个月，80℃下加热15min不被破坏。提高溶液的pH值，其稳定性则降低。20℃下，在0.lmol/LHCI或 0.1mol/LNaOH中，可稳定15min，在pH=13的条件下经80℃处理15min即完全失活。

对现有技术中天然水蛭素的生产方法检索到的一些技术方案如下：

1.          中国专利：03113566.8发明名称：菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术。摘要：本发明提供了一种菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，是通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭，进行人工分级分段驯、喂养，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液进一步分离过滤得到水蛭素粗品，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素，该菲牛蛭含抗凝血物质比其它品种菲牛蛭含量高，药用效果好，提取水蛭素方法简单，提取水蛭素后将菲牛蛭放回水池养殖，相隔一周或十天又可以再提取，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫克左右，产品质量好，又节约资源，提高了菲牛蛭的利用价值。

2.          中国专利：200610019531.0发明名称：一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用。摘要：本发明公开了以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用，该制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。本发明具有工艺简单，生产成本低、产品保存期长、并可采用Matkwatdt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素含量，从而使质量稳定，产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛，可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其他动、植物药制成复方制剂，用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。