[发明专利]一种用于克隆含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的DNA分子及克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法。

背景技术

蚕丝是天然动物蛋白纤维，包括家蚕丝和野蚕丝（柞蚕丝、天蚕丝等）。家蚕丝素由于来源丰富，也是研究的热点，学者对其结构、性能及生物材料应用方面进行了大量的研究。然而，有关野蚕丝素方面的研究国内外报导极少。

再生野蚕丝素溶液及膜的分子构象以α-螺旋结构和无规卷曲结构为主，经过乙醇溶液处理的野蚕丝素膜的β-折叠结构含量增加。天蚕丝素来源比较稀少，有报导将编码天蚕基因导入家蚕中进行表达并从家蚕分泌的丝物质中检测到天蚕丝素蛋白。野蚕丝素蛋白肽链上含有一种特殊的序列：精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列，柞蚕丝素蛋白分子含有12个RGD，约占柞蚕丝素氨基酸残基总数的1.35%。天蚕丝素蛋白分子含有14个RGD，约占天蚕丝素氨基酸残基总数的1.7%。这种RGD三肽序列广泛存在于胶原蛋白、粘着蛋白等细胞外基质中，有助于细胞粘附，促使贴壁细胞粘附生长。研究发现，经RGD化学修饰的丝素膜及其他改性材料如高分子聚合物等都能提高细胞粘附率。

因此预见野蚕（柞蚕和天蚕）丝素蛋白对细胞的亲和性比家蚕丝素蛋白更好，有作为高性能的生物材料的巨大潜力。经过对再生野蚕丝素蛋白的体外生物相容性的初步研究，发现再生野蚕丝素材料可以很好地支持大鼠骨髓间充质干细胞的粘附与增殖。

报导认为材料并不是有RGD的存在就一定有良好的促细胞黏附和增殖功能，还与RGD在肽链中的位置有关。为合理科学地设计野蚕丝素蛋白生物材料，首先必须知道肽链中RGD与细胞粘附性之间的规律性。因此，揭示野蚕丝素蛋白的组成与其生物学功能的关系具有重要意义。

传统的方法主要采用溶解蚕丝获得再生丝素蛋白的方法来研究其性能，但无法说明其生物学性能的结构（序列）。丝素蛋白研究方面，有学者通过化学合成肽段来研究其结构性能，但化学合成并不能合成大分子量的蛋白，而蛋白的分子量和聚合度与蛋白的结构或性能密切相关。Kozo Tsubouchi研究组将家蚕丝素用胰乳蛋白酶消化，分离出各种肽段，通过序列鉴定和细胞培养，发现丝素H链N-末端有2段基序NINDFDED和VITTDSDGNE对人皮肤成纤维细胞增殖有促进作用。但这种方法获得的是各种肽段混合液，种类繁多，分子量各异，肽段分割、精确分离复杂，不易获得高纯度的单序列。采用基因工程技术来研究其组成与生物学功能的关系，有研究报导，通过大肠杆菌表达获得的含RGD三肽的重组蛋白[TGRGDSPA(GVPGV)₂GG(GAGAGS)₃AS]_n表现出良好的细胞粘附与增殖能力；与RGD序列共混的再生家蚕丝素蛋白以及重组RGD蜘蛛丝蛋白能支持未分化的小鼠成骨细胞的分化；将RGD重组蜘蛛丝和聚乙烯醇高分子材料结合能支持鼠胚胎成纤维细胞的生长。但是上述研究并不能够揭示重复多次的RGD分布与天蚕丝素蛋白可能具有的出色的促细胞粘附性之间的关系。

目前，提供用于修饰高分子材料的RGD短肽的方法多采用化学合成技术。化学合成方法只能得到分子量较小的多肽，很难得到大分子量的肽，所以难以进一步研究重复多次的RGD分布与野蚕丝素蛋白的促细胞粘附性之间的关系。因此，本发明提供了一种野蚕丝素蛋白基序及野蚕丝素蛋白基因的克隆方法，用于获得野蚕丝素蛋白RGD重复序列，以期研究野蚕丝素丝蛋白RGD三肽及其重复序列与其生物学功能的关系。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法。该克隆方法操作简单，准确度高；获得的单倍、双倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列结果准确。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子，其编码链的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因重复序列的方法，包括如下步骤：

步骤1：合成编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；所述DNA分子的编码链序列的5’端含有BglII的粘末端碱基，3’端具有BamHI的粘末端碱基，所述BglII位点的上游还具有AgeI的粘末端碱基；