[发明专利]一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法

权利要求书

1.一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：

(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，20-37℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20-37℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K₂HPO₄.3H₂O 0.5-2g/l，KCl 0.5-2g/l，MgSO₄．7H₂O 0.5-2g/l，FeSO₄.7H₂O 0.1-1g/l，琼脂15-20g/l，溶剂为水，初始pH 6.0-7.5；

(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25-37℃，摇床转速150-200rpm，培养1～7天，得到发酵液，取发酵液于4000-12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖10-120g/l，葡萄糖10-50g/l，黄豆饼粉5-25g/l，碳酸钙2-10g/l，甘油2-10g/l，谷氨酸钠2-10g/l，溶剂为水，初始pH6.0-7.5；

(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30gl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40gl，pH6.0、50mmol·L^-1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol/12-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L^-1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒读一次数，直至Abs₄₀₅不再增加，将Abs₄₀₅相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述平皿培养基或斜面培养基按以下方法制得：水中加入琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K₂HPO₄·3H₂O，KCl，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，并搅拌至完全溶解，配制得到终浓度为：蔗糖5-30g/l,蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-2g/l，KCl 0.5-2g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/l，FeSO₄/7H₂O 0.1-1g/l，琼脂15-20g/l的溶液，调节pH 6.0-7.5，121℃灭菌20min，冷却到60℃，在无菌条件下，倒入无菌的试管中，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；在无菌条件下倒入无菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。

3.如权利要求1所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：

(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，FeSO₄·7H₂O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH7.0；

(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度28℃，摇床转速150～200rpm，培养7天，得到发酵液，取发酵液于10000～12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；

(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释25-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30gl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5 mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,5mmol/l2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒读一次数，直至Abs₄₀₅不再增加，将Abs₄₀₅相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。