[发明专利]一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法

说明书

本申请是专利申请号2010106059123的分案申请，原申请的发明名称：α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法，申请日：2010年12月25日。 

（一）技术领域

本发明涉及到一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法。 

（二）背景技术

糖尿病是一种重大多发性疾病，在世界范围内普遍存在。由于生活方式的巨大转变以及人们保健意识的不足，目前我国糖尿病患者已达9240万人，其中男性5020万人，女性4220万人，超过印度，成为世界糖尿病患者最多的国家，发病率（9.7%）仅次于美国（11%），其中II型糖尿病患者占93.7%。目前常用的治疗II型糖尿病药物有：增加胰岛素敏感性的双胍类——甲福明；促胰岛素分泌的磺酰脲类——格列齐特（Gliclazide，商品名唐并康）；α-糖苷酶抑制剂——阿卡波糖、米格列醇（Miglitol，商品名奥恬苹）、伏格列波糖（Voglibose，商品名倍欣）。其中由于α-糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，得到越来越多国内外研究者的青睐。 

在中国，人们膳食结构中以谷类为主，碳水化合物含量高，餐后血糖水平易升高，而糖苷酶抑制剂可以很好的缓解II型糖尿病患者的症状。因此，糖尿病患者对糖苷酶抑制剂类治疗药物有着巨大的需 求。α-淀粉酶抑制剂作为这一类物质的代表，备受关注。 

α-淀粉酶（α-amylase）为1,4-α-D-葡聚糖水解酶，能够水解淀粉、糖原以及相关多糖为寡糖片段。在消化、吸收过程中，食物中的碳水化合物先经唾液α-淀粉酶、胰α-淀粉酶作用分解为寡糖，然后在小肠中经α-葡萄糖苷酶分解为单糖，最后被小肠上皮细胞吸收进入血液循环。α-淀粉酶抑制剂作为一种糖苷水解酶抑制剂，能有效抑制唾液α-淀粉酶和胰α-淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少葡萄糖的产生和摄取，降低血糖和血脂含量水平。在临床上淀粉酶抑制剂可有效预防与治疗糖尿病和高脂血症。既可单独使用，也可以与其他降糖药或降血脂药联合使用。临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等症，如阿卡波糖已成为糖尿病治疗的首选药物。 

根据文献和专利报道，α-淀粉酶抑制剂的筛选是以淀粉酶活性抑制为基础，测定方法主要包括碘比色法（US3876766）和3,5-二硝基水杨酸（DNS）法（Bernfeld法）。其中碘显色法属半定量方法，灵敏度低。3,5-二硝基水杨酸法筛选α-淀粉酶抑制剂基于以下原理：淀粉在胰α-淀粉酶作用下水解产生的还原基团，将3,5-二硝基水杨酸与还原为硝基氨基水杨酸，从而产生颜色变化。通过在波长546nm处测定吸光度(Abs546)可以判断上述反应的进行。由于α-淀粉酶抑制剂对淀粉水解有抑制作用，可使Abs546值下降，从而可以计算待测物对淀粉酶活性的抑制率。测定时，一般通过调整待测溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量，使Abs546的值在0.4～0.7范围内为宜。但该反应中可溶性淀粉与α-淀粉酶对测定系统本底Abs546值的影响接 近0.2，对测定区间0.4-0.7而言本底影响较大，而且难以测定抑制剂浓度与酶活的关系。同时该反应显色需经沸水浴，无法实现在96孔板上进行，不能利用酶标仪等进行高通量筛选。目前，还没有高效、灵敏、快速的微生物源α-淀粉酶抑制剂筛选方法报道。 

（三）发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏的α-淀粉酶抑制剂筛方法。 

为达到发明目的本发明采用以下技术方案： 

α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。 

本发明所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为： 

（1）待筛选菌株接种到平皿培养基上，20~37℃（优选28℃）培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20~37℃（优选28℃）培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5-30g/L，蛋白胨1-5g/L，酪氨酸0.5-2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-2g/L，KCl 0.5-2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，琼脂15-20g/L，溶剂为水，初始pH6.0-7.5；