[发明专利]一种人工锌指核酸酶表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种构建锌指核酸酶表达载体的方法和利用该载体突变标记基因（增强型绿色荧光蛋白）的方法。

背景技术

用增强绿色荧光蛋白（ECFP）和新霉素抗性基因（neo）作为标记基因筛选转基因细胞的方法已广泛应用于动物转基因体细胞核移植实验中。但用这种方法获得的转基因动物携带有标记基因，在其体内表达标记基因的蛋白产物可能会产生生物安全性的问题。因此,在动物育种前必须把转基因动物细胞中的标记基因删除，然后用这种细胞进行体细胞核移植实验获得无标记基因的动物。

目前，删除或突变转基因动物细胞标记基因的一种方法是构建表达Cre酶的载体，然后用这种载体转染细胞，通过在细胞中表达Cre酶的方法来删除或突变标记基因。但这种方法需要事先在标记基因的两端添加一个LoxP序列，而且删除或突变标记基因的效率低。另一种方法是构建含有与标记基因两端同源序列的打靶载体，用这种打靶载体转染细胞，通过同源重组的方式删除细胞中的标记基因，但构建这种载体过程也较繁琐，筛选细胞时间长，效率极低（1x10^-6以下），且获得的细胞活力较差，大多数细胞接近死亡。

锌指核酸酶（ZFNs）基因删除或突变技术是近年来发展的一项基因打靶技术。锌指核酸酶表达载体是由一个识别特定DNA序列的锌指蛋白域和非特异性核酸内切酶（FokI）组成，其删除或突变基因的效率非常高，可达到1x10^-1，并具有极高的特异性，且不需要事先在标记基因两端添加LoxP位点。根据网站上公开的软件进行设计，通过简单的分子生物学技术就可构建针对特定基因序列（如标记基因）的特异性锌指核酸酶表达载体，方法简单可靠；用这种类型的载体转染细胞，在细胞中表达锌指核酸酶可使删除或突变基因的效率提高几个数量级，效率显著提高，且获得的细胞活力较好。随着锌指核酸酶介导基因打靶技术的发展和成熟，农业育种和包括为人类疾病和器官移植的大动物模型在内的医学研究等将毫无疑问受益于此项新技术。

目前，还没有以增强绿色荧光蛋白标记基因的特定位点序列（gACAATCTTCTTTAAGGATGATGGAa）为靶序列，设计锌指核酸酶表达载体的方法来删除或突变标记基因的研究。

发明内容

为了提高删除或突变标记基因（增强绿色荧光蛋白基因）的效率，本发明采用了一种新型的锌指核酸酶打靶技术，即构建了一对人工锌指核酸酶表达载体，将载体片段转染含增强绿色荧光蛋白标记基因的细胞，突变细胞中增强绿色荧光蛋白标记基因的效率在4.8-20.8%之间。

本发明中将增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因序列输入到CoDA软件（www.zifit.partners.org）上并进行分析，选取位于外显子中序列(gACAATCTTCTTTAAGGATGATGGAa)的一对左右侧锌指蛋白域，构建人工锌指核酸酶表达载体。

本发明公开了一种人工锌指核酸酶表达载体，它通过下述方法构建得到：将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列，分别插入到载体pMLM290、pMLM292上的Xba l/BamH I位点而获得。

所述人工锌指核酸酶表达载体的具体构建方法，是先人工合成编码左右侧锌指蛋白域的基因序列，左右侧锌指蛋白域的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，然后分别用Xba l/BamH I双酶切上述人工合成基因片段，用凝胶回收试剂盒回收酶切产物片段，然后将回收片段分别插入到载体pMLM290/292上的Xba l/BamH I位点上，构建成一对表达锌指核酸酶的质粒载体pLZFP1729和pRZFP1729，载体结构如图3和图4。

本发明还公开了上述载体pLZFP1729和pRZFP1729在突变转基因细胞或转基因动物中的增强绿色荧光蛋白标记基因中的应用。

一种用pLZFP1729和pRZFP1729突变转基因细胞中的增强绿色荧光蛋白标记基因中的方法，包括如下步骤：

（一）用ApaL I和Nru I分别双酶切质粒pLZFP1729和pRZFP1729，凝胶回收3313bp片段备用。

(二)锌指核酸酶突变增强绿色荧光蛋白标记基因

（1）细胞培养与转染

①（转增强绿色荧光蛋白基因）奶公羊（F1代）与正常母羊配种，利用常规细胞分离培养技术分离培养到2~3个35日龄（转基因）山羊胎儿的成纤维细胞；