[发明专利]一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法

权利要求书

1.一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法，其特征在于包括下列步骤：

1)大豆种子的基因型选用、消毒和萌发，具体包括：

1.1大豆种子的基因型选用“吉豆2号”，且需挑选发育饱满无病害的；

1.2用常温氯气熏蒸法，其中氯气由100ml5.24％NaCIO+3.5ml12mol／L HCI产生，置于干燥器中熏蒸14h进行灭菌；

1.3在超净工作台中取出无菌大豆，接于无菌湿蛭石表面下方1-2cm处，用保鲜膜封盖；

1.4置于25℃暗培养室中进行诱芽的培养，5d后，以备进行发根农杆菌侵染；

2)含有抗线虫Bt基因的发根农杆菌K599菌液的制备，具体包括：

2.1将包含植物双元表达载体pBI121-Bt06的发根农杆菌K599，在固体LB平板上划线，28℃倒置培养48h；所述的包含植物双元表达载体pBI121-Bt06的发根农杆菌菌株K599是通过常规的农杆菌冻融法将pBI121-Bt06质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞获得；

2.2挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，220rpm、28℃振荡培养24h；

2.3按1：10的比例将摇好的菌液加入到50mL液体LB培养基中，220rpm、28℃振荡培养3-6h，使菌液OD₆₀₀达到1.3；

2.43000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬浮于侵染液中：MSB+100μmol/L As，pH5.4，使其OD₆₀₀稀释至0.5，备用；

3)发根农杆菌介导的大豆转化，具体包括：

3.1在萌发的大豆种子的下胚轴的上端，用解剖刀划伤后放至制备好的农杆菌侵染液中，在0.06-0.08MPa真空压力条件下侵染10-20min，同时以无菌水作为对照；

3.2将侵染后的大豆移至花盆中，并用灭菌的混蛭石将其覆盖，25℃、12h光照，保持湿度在75％以上，温室培养2-3周，培养期间每天用无菌的B&D溶液浇灌植株，其中B&D溶液是由500μL SolutionA，500μL Solution B，500μL Solution C，500μL Solution D组成，其中包含0-2mmol/L硝酸钾作为氮源，Solution A为2mol/L二水合氯化钙，Solution B为1mol/L磷酸二氢钾，Solution C为20mmol/L柠檬酸铁，Solution D为0.5mol/L硫酸镁、0.5mol/L硫酸钾、2mmol/L硫酸锰、4mmol/L硼酸、1mmol/L硫酸锌、4mmol/L硫酸铜、0.2mmol/L硫酸钴、0.2mmol/L钼酸钠；

3.3当根长到5-10cm时，将新发出的根以下1cm处的初生根切去，并将植株移到新的花盆中，用湿蛭石复盖后，置于温室继续培养；

4)转基因根的组织化学染色分析，具体包括：

4.1取侵染后新发出的大豆根部和对照的根部，分别与X-Gluc染色液混合培养，避光37℃放置过夜；所述的X-Gluc染色液的配方为：3mg/ml X-gluc、50mM PH=7.0的磷酸钠缓冲溶液、10mM EDTA、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100、10％甲醇；其中的X-gluc为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸，其中的百分比为体积百分比；

4.2弃去染色液，用25％、50％、75％和100％酒精浸泡进行脱色，观察并拍照记录GUS的表达情况，其中的百分比为体积百分比；

5)转基因根的PCR检测，具体包括：

5.1根据Kan序列对其设计引物如下：

上游序列5'-TTGGGTGGAGAGGCTATTCG-3'

下游序列5'-TATCACGGGTAGCCAACGCT-3'；

5.2用CTAB法提取生长旺盛的毛状根的DNA，以DNA为模板对Kan基因进行PCR扩增，若PCR扩增出预期大小为641bp的目的条带，与预计大小一致，测序验证为Kan基因序列，而野生型根未能扩增出任何条带，表明获得的毛状不定根为转基因不定根。

2.按权利要求1所述的发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法，其特征在于步骤2.1所述的包含植物双元表达载体pBI121-Bt06的发根农杆菌菌株K599是通过常规的农杆菌冻融法将pBI121-Bt06质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞获得。

3.按权利要求1所述的发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法，其特征在于步骤4.1所述的X-Gluc染色液的配方为：3mg/ml X-gluc、50mM PH=7.0的磷酸钠缓冲溶液、10mM EDTA、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100、10％甲醇；其中的X-gluc为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸，其中的百分比为体积百分比。