[发明专利]一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学与基因工程技术领域，具体涉及利用发根农杆菌介导真空渗透辅助大豆遗传转化的方法及其应用。

背景技术

大豆是重要的粮食作物和经济作物，但受各种病、虫害及各种非生物逆境的影响，大豆的品质和产量难以满足人们的需求。大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode，简称SCN)，是由大豆胞囊线虫侵染引起的，是危害世界大豆生产最严重的病害之一，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、休眠体(胞囊)存活时间长，是一种极难防治的土传病害。在我国东北和黄、淮、海大豆产区发生较普遍，一般可使大豆减产5％-10％，严重的可达30％以上，甚至绝产(刘维志，2000)。在生产上，目前对大豆胞囊线虫的防治主要是使用化学农药，但是这种单纯的使用化学防治会引发土壤微生物区系紊乱、使线虫的抗药性增强，因此使人们越来越关注化学农药的残留和对环境污染的问题。近年来，现代分子生物学的技术在对植物病虫害的防治中展现出了很好的发展前景。利用基因工程的方法对大豆进行抗病虫品种的培育是非常有必要的，同时对大豆遗传转化的条件进行进一步的优化也有利于遗传转化效率的提高，意义重大。

Bt基因是最早应用于抗虫基因工程的抗虫基因。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，在芽孢形成的过程中可以形成伴胞晶体，此晶体具有杀线虫的作用，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。1990年，Perlak等(1990)获得了转Bt基因的棉花。在此之后，转基因抗虫水稻也相继获得成功。Stewart等(1996)将合成的Bt基因利用基因枪轰击的方法来轰击悬浮培养体细胞胚，获得转基因大豆株系。后期，人们开始尝试用具有非竞争性结合关系的复合Bt基因或用Bt基因与其它抗虫基因构建的复合杀虫基因载体来转化大豆，得到相应的转基因植株。

基因工程的方法能够使我们将有益目的基因定向地转移到农作物中，使农作物达到提高抗性和改良品质的目的。但是相对于水稻、烟草等作物来说，大豆的高效遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一，自Hinchee等(1988)和McCabe等(1988)分别用两种方法转化大豆成功得到转基因植株以来，虽然也相继有关于此方面的报告，但是突破性的进展却很少见到报告。具体来说最重要的一点就是转化效率没有显著提高。尽管目前转基因大豆已在全球大面积种植，但其遗传转化仍局限于根癌农杆菌介导的子叶节转化系统、基因枪介导的体细胞胚转化系统、胚悬浮培养转化系统等方法。这些转化系统普遍存在嵌合体频率高、受基因型限制、转化系统稳定性较差等问题，限制了转基因材料的批量创制和候选基因育种应用价值的快速评价。

目前应用较为广泛的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)两种。它们的寄主非常广泛，且为革兰氏阴性菌；在普通情况下，能通过原有的或后天制造的伤口来感染植物细胞，且分别能够形成冠瘿瘤和生出毛状根。

根癌农杆菌中含有Ti质粒(Tumor-inducing plasmid)，它与肿瘤诱导有关。这种Ti质粒可以使T-DNA转移到植物的细胞中并整合进植物的基因组中得以表达，从而导致冠瘿瘤的发生，而且这些整合进植物基因组的T-DNA片段又可以通过减数分裂的方式传递给子代(贾士荣等，1994)。发根农杆菌与根癌农杆菌不同的是它含有Ri质粒，该质粒上包括能够使发根瘤自主生长并且使冠瘿碱合成的基因。含有Ri质粒的T-DNA通过伤口侵入植物的茎基部，使不定根和侧根大量发生，进而使目的基因整合入植物的基因组中，从而稳定表达，出现毛状根(Chilton et al，1982)。与根癌农杆菌相比，发根农杆菌Ri质粒诱导形成的毛状根，生长速度快，生长条件可以人为控制且遗传上稳定，因而可以作为研究作物根部寄生的病虫害病理的良好材料，毛状根系统在研究与根系相关的理论中也是理想的实验系统。因此，自从Ri质粒被人们发现并认识以来，发根农杆菌现已被广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、植物品种改良和植物栽培等领域，为人类生产作出了巨大贡献，具有极其重要的研究价值和广阔的应用前景(杜曼等，2005)。