[发明专利]葡萄溃疡病菌快速检测引物及其应用

权利要求书

1.一对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。

2.一种检测葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum菌种的试剂盒，包括权利要求1所述的引物。

3.权利要求1所述的引物在辅助鉴定葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum菌种中的应用。

4.权利要求2所述的试剂盒在辅助鉴定葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum菌种中的应用。

5.一种鉴定葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum菌种的方法，包括下述步骤：

1）待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

2）鉴定步骤1）所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个370bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有Neofusicoccum parvum菌种的样品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为PCR反应体系为25μL，包括：待测样品DNA，上游正向引物和下游反向引物的终浓度均为0.2μmol/L；dATP、dCTP、dGTP和dTTP的终浓度均为2.5mmol/L；2.5μL 10×PCR缓冲液；Taq DNA聚合酶添加终浓度为0.05U/μL，其余部分用ddH₂O补足；所述10×PCR缓冲液为由100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl₂组成的溶液；

PCR反应程序为：94℃预变性4min；30个循环的94℃45s，61℃30s和72℃30s；72℃延伸10min。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述待测样品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步骤如下：

1）将待测样品称重后，每mg样品加入30μL 0.5mol/LNaOH溶液，充分研磨；

2）将步骤1）研磨后的样品离心取上清液，每10μL上清液加入490μL 0.1mmol/LpH8.0的Tris-HCl，混匀后得到待测样品DNA，直接用于PCR反应。