[发明专利]一种尖吻蝮蛇溶栓酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种尖吻蝮蛇溶栓酶及其制备方法和应用。

背景技术

从六十年代至今的半个世纪中世界各国科学工作者对蛇毒的开发利用做了大量研究工作，截止到目前已从蛇毒中分离到了几十种蛇毒酶。这些酶从功能角度划分主要为两大类，一类为类凝血酶（thrombin-like enzyme,简称TLC），其作用为通过凝血达到止血；另一类为纤溶酶（fibrinolytic enzymy，简称FE），其能够水解纤维蛋白原和纤维蛋白，其作用为溶栓和降低血液粘度。

在溶栓酶中比较典型的代表产品为日本生产的东菱克拴酶，该酶是从巴西蝮蛇的蛇毒中分离得到，由231个氨基酸构成，分子量36kD。后经基因克隆发酵生产，其主要成分为巴曲酶（Batroxobin）。该药1994年进入我国，其主要作用为溶栓，临床用于治疗脑梗塞、冠心病、肺心病和下肢静脉血栓。

我国科研工作者在蛇毒纤溶酶开发领域中也取得一定成果。1979年郝文学等从蛇岛黑眉蝮蛇（Agkistondon chalys saxatilis）提取到一种纤溶酶，取名蛇岛腹抗拴酶。1981年陈建智和覃公平等从东北白眉蝮蛇蛇毒中分离到一种纤溶酶，取名清栓酶。1985年郝文学与陈智远等从浙江蝮蛇（Agkistondon chalys pallas）中发现了一种溶栓酶，命名为抗拴酶－3号。之后汤圣希和舒雨雁等从尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）中也精制提取到了溶栓酶。

1992年肖昌华从3g从尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）中到380mg祛纤酶组分，收率12.6％。2004年吴梧桐等在武夷山尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）中分离得到一个具有溶栓作用的酶，该酶由两个相同亚基组成，分子量30298D，并进行了N末端15个氨基酸序列测定。2006年孙明忠等报道从长白山白眉蝮蛇（Agkistrodon blomhoffii ussurensis）中分离到一个约26kD纤溶酶组分，收率4%。

本发明人从我国的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus，俗称五步蛇)蛇毒中分离纯化得到一种单组分具有纤溶活性的溶栓酶。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种尖吻蝮蛇溶栓酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的一种具有溶解纤维蛋白活性的酶。

本发明的另一个目的在于提供一种制备上述溶栓酶的方法。

本发明的还一个目的在于提供上述溶栓酶在制备治疗脑梗塞、冠心病、肺心病或下肢静脉血栓的药物中的应用。

本发明的溶栓酶是从中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）蛇毒冻干粉中分离得到的溶栓酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白含197个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；②分子量为22783D；③等电点pI为5.4；④体外能够水解纤维蛋白；⑤酶活性可被苯甲基磺酰氟（PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。

本发明还提供上述溶栓酶的制备方法，其包括如下步骤：

1）预处理蛇毒冻干粉；

2）洗脱预处理后的蛇毒溶液，收集NaCl溶液的洗脱液；

3）步骤2）中的洗脱液经浓缩、透析去除NaCl；

4）再次洗脱步骤3）中透析后的溶液，收集NaCl溶液的洗脱液；

5）步骤4）中的洗脱液经浓缩、透析去除NaCl；重复步骤4）和5）一次以上。

其中，步骤1）蛇毒预处理的方法是将蛇毒用预冷的0.01MpH7.0～7.5PBS溶解，溶解液经离心、透析或超滤浓缩，得蛇毒浓缩液。其中透析袋截留分子量为7,000D~10,000D；采用切向流超滤，超滤膜截留分子量为5,000D～10,000D。将离心上清液稀释2-5次、超滤浓缩。通过预处理可以去除不溶的杂质以及小分子多肽，并降低溶液离子强度。

具体地说可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5~10倍体积预冷的0.01M pH7.0～7.5的PBS于4~8℃的层析柜中搅拌溶解30~60分钟，于4~8℃、5,000～10,000g离心10~20分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀再次加入蛇毒重量5~10倍体积预冷的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液于透析袋(截留分子量为7,000D~10,000D)中，在4~8℃层析柜中对0.01MpH7.0～7.5的PBS透析12~24小时，期间换液2~4次，以去除小分子多肽和降低溶液离子强度。