[发明专利]一种缩短植物细胞悬浮培养周期的方法

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术领域。

背景技术

细胞悬浮培养是生产植物次生代谢物的重要手段之一。但是，植物悬浮细胞生长速度缓慢、培养周期长成了细胞悬浮培养的环节多、成本高等关键问题。本发明利用RNAi原理，通过降低植物p53基因的表达，以达到缩短植物悬浮细胞培养周期、提高细胞培养密度目的。

发明内容

构建植物细胞表达载体。

通过比对Genbank注册的植物p53基因的核苷酸序列，选定其两个保守区各30-100个碱基对的核苷酸序列分别为正向片段I和II，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’)；根据两对正、反序列设计出合适的引物，在PCR扩增过程中，使正反片段分别引入限制性内切酶位点(EcoR I和Hind III)和相应的GU-AG内含子端部序列。经过酶切、再连接、转化、克隆和鉴定后，得到了四片段的I-AC-II’-II-CT-I’序列产物；该产物插入到pCAMBIA2300植物表达载体，导入农杆菌感受态EHA105，筛选出能转化植物的工程菌。

以甘草为例获得甘草转化体。

从甘草幼苗的上胚轴上诱导愈伤组织；早期愈伤组织与农杆菌工程菌共培养；随后在含抗生素的培养基中进行选择培养，筛选出抗性愈伤组织并进行继代培养；将松散的抗性愈伤组织在液体培养基振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得稳定的悬浮细胞。

高产悬浮细胞系的筛选。

利用看护培养手段，从悬浮细胞中筛选生长速度快的单细胞系愈伤组织；将该愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得由单细胞和小细胞团组成的悬浮系；对该悬浮系的细胞生长周期、主要代谢产物含量进行等鉴定并稳定性试验，获得的生长悬浮细胞作为种子进入大规模。

细胞悬浮培养基及培养条件的优化。

通过培养基和培养条件的优化，获得植物细胞生长和产物积累的最适碳氮源、pH、温度、溶氧量和最佳接种量等发酵工艺参数，为进一步进行大规模细胞悬浮培养提供了依据。

主要用途

利用本发明方法获得的培养周期短、成本低、生产效率高的细胞，将在大规模开发和生产药用植物有效成分方面将发挥着关键作用。

具体实施方式

以甘草为例-干涉p53基因制备生长周期短的细胞悬浮系的方法

构建植物细胞表达载体

通过Genbank注册的所有植物p53基因的核苷酸序列，选定其两个保守区各50个碱基对的核苷酸序列分别为正向片段I和II，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’)；根据两对正、反序列设计出合适的引物，在PCR扩增过程中，使正反片段分别引入限制性内切酶位点(EcoR I和Hind III)和相应的GU-AG类内含子端部核苷酸序列。结果见表1。经过酶切、再连接、转化、克隆和鉴定后，得到了四片段的I-AC-II’-II-CT-I’序列产物；该产物插入到pCAMBIA2300植物表达载体，导入感受态农杆菌EHA105，筛选出能转化植物细胞的工程菌pCAM-RNAi-p53。

表1 p53基因保守区域DNA片段及其PCR引物的核苷酸序列

注：表的框中和下划线上核苷酸为非膨胀素基因的核苷酸序列。

获得甘草细胞转化体

从甘草幼苗的上胚轴上诱导愈伤组织；早期愈伤组织与农杆菌工程菌EHA105共培养；随后在含抗生素的培养基中进行选择培养；对形成的抗性愈伤组织进行GUS组织化学染色、抗性基因的PCR鉴定；对鉴定阳性的愈伤组织进行继代培养2-5次直至形成松散型愈伤组织；将松散的抗性愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得稳定的悬浮细胞系；对形成的悬浮细胞进行报告基因gus蛋白的组织化学染色、抗生素抗性基因的PCR鉴定，以确定其是否为转化的悬浮细胞系。

筛选甘草酸高产悬浮细胞系

利用分裂旺盛的甘草愈伤组织在滤纸上进行看护培养；从悬浮细胞中筛选生长速度快的单细胞系愈伤组织；将该愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物经过筛后继续进行悬浮培养，获得由单细胞和小细胞团组成的悬浮细胞系；对该悬浮系的细胞生长周期、甘草酸等含量进行等测定；接着进行稳定性试验，最终获得的高产悬浮细胞系作为种子进入大规模培养。结果见表2。由表可知，与非转化细胞相比，转化细胞的大小、密度、生长周期和倍增时间均有很大改进，其中生长周期缩短近1周时间。

表2悬浮培养中的转化细胞与对照的比较