[发明专利]一种以高速逆流色谱技术纯化制备茶多糖复合物的方法

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及一种从茶叶特别是低档茶叶中纯化制备茶多糖复合物的技术方法，属于农产品深加工领域。

背景技术

茶多糖是目前热点研究的植物活性多糖之一，其全称为茶叶多糖复合物(tea polysaccharide conjugates, TPC),是一种多糖成分占主要部分并结合蛋白质的杂聚多糖复合物。 TPC的多糖链部分由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和微量的葡萄糖醛酸等单糖共价结合而成；约16种氨基酸组成其结合蛋白质或肽链部分。茶多糖复合物具有多方面的生理调节功效，如降血糖、增强免疫和抗氧化等。

目前，茶多糖复合物的制备是以茶叶特别是低档茶叶为原料，采取热水（沸水）煎煮、超声波处理、复合酶法等提取技术获得茶叶粗多糖，然后经离子交换如DEAE-纤维素、凝胶如Sephadex G系列等柱层析技术制得纯化的茶多糖复合物。其柱层析纯化所用填充料价格昂贵，只适用于实验室研究分析。因此，研究开发一种低成本、高收率、能进行工业化生产的茶多糖复合物纯化制备技术将有利于茶多糖复合物的广泛应用。

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography, HSCCC）是新型的液-液分配色谱技术，它采用多层螺旋管同步行星式离心运动，在短时间内能实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中的高效分配，从而实现样品分离。HSCCC用于天然产物制备的优点在于处理量大、目标产物得率高、分离效果好、分离介质成本低廉且可循环使用等。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高速逆流色谱技术纯化制备茶多糖复合物的方法。 本发明所采取的技术方案包括如下步骤:

（1）以茶叶为原料，粉碎机粉碎后，加入质量体积比（W/V,千克/升）为1:（5-30）的水，于40-95℃处理0.5-12小时，然后用纱布过滤，得滤液，滤液离心后，经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入4倍体积95%乙醇，静置2-12小时，获得乙醇沉淀物，将沉淀物冷冻干燥，得茶叶粗多糖。

（2）配制高速逆流色谱所需的双水相体系：将聚乙二醇溶解于水，使其质量百分比浓度为4-32%，作为高速逆流色谱的固定相。所使用的聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和聚乙二醇8000中的1种或2种。其中，使用2种聚乙二醇者，二者质量比为1:1。配制质量百分比浓度5-35%的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲溶液，并使其pH达到4.0-9.0，作为高速逆流色谱的流动相。

（3）高速逆流色谱分离纯化茶多糖复合物：用步骤（2）中所述的固定相配制茶叶粗多糖溶液。先用恒流泵将固定相充满高速逆流色谱分离柱，再以0.5-10.0ml/min的流速注入茶叶粗多糖溶液，然后开启高速逆流色谱仪分离柱的转速至200-1000rpm，并以0.2-20.0 ml/min的流速泵入步骤（2）所配制的流动相，进行分离纯化，用自动分步收集器收集高速逆流色谱仪出液管的分离液，采用蒽酮-硫酸法或苯酚-硫酸法检测收集管的糖含量浓度，以糖含量浓度为纵坐标，收集管号为横坐标，制作洗脱曲线，将洗脱曲线的每一个洗脱峰所对应收集管的收集液分别合并，获得合并收集液。根据洗脱峰的个数，获得相应个数的合并收集液。

（4）将步骤（3）中所述的合并收集液分别经截留分子量为2000-10000道尔顿的透析袋流水透析5-72小时，透析后的各合并收集液分别经膜孔径截留分子量为2000-20000道尔顿的超滤膜浓缩，超滤浓缩液经真空冷冻干燥或喷雾干燥获得茶多糖复合物的高速逆流色谱纯化组分。

所述步骤（1）中所用茶叶原料为绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶（青茶）、红茶、黑茶种类中的任一种。

本发明的有益效果在于，该方法工艺流程简单，分离介质为双水相体系，可循环使用，绿色环保；茶多糖复合物的得率高、纯度高；成本低廉，易于工业化制备。

具体实施方式

实施例1：

(1)以绿茶中的炒青茶片1千克为原料，粉碎机粉碎后，加入质量体积比（W/V,千克/升）为1:10的水，即10升，于85℃处理5.5小时，然后用纱布过滤，得滤液，滤液离心后，经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入4倍体积95%乙醇，静置5小时，获得乙醇沉淀物，将沉淀物冷冻干燥，得茶叶粗多糖85.5克。