[发明专利]一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种蟆叶秋海棠(Begonia rex)组织培养的繁殖方法。

背景技术

蟆叶秋海棠(Begonia rex)，秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)多年生草本观叶植物，原产巴西和鳊东部一带，叶形优美，叶色绚丽，是室内极好的观叶植物。性喜温暖、湿润、半阴及空气湿度大的环境，忌强光直射。生长适温为22-25℃，不耐高温，气温超过32℃则生长缓慢。

蟆叶秋海棠，根茎肥厚，粗短，叶宽卵形，边缘有深波状齿牙。叶绿色，叶面上有深绿色纹，中间有银白色斑纹，叶背为紫红色。叶和叶柄上密生茸毛，花较小，为淡红色。6-9月开花，聚伞花序，花朵饱满呈水红色，袅娜娇艳，亦颇具观赏价值

然而，作为秋海棠属植物的一种，其种子不易获得，有性繁殖能力弱，且后代多变异，优良性状难以保持。植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一，具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点，因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖，目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产，秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于蟆叶秋海棠组织培养的报道较少，何勇等通过蟆叶秋海棠的幼嫩叶片外植体进行组织培养，得出了再生植株，但只是重点研究了愈伤组织的诱导试验，并没有对增殖方法进行摸索(《蟆叶秋海棠离体培养的研究》，湖北农业科学，2009年第8期，1814-1816页)，本申请实验室之前申请相关专利申请201010504126扦插时间较长，且增殖率较低。本申请课题组曾发表文章《蟆叶秋海棠“光灿”组织培养技术研究》，江西农业学报，2011年12期，然而，其整体增殖率较低，一个培养周期(70d左右)增殖率仅为80.5倍，且组培周期相对较长，现有技术中亟需一种蟆叶秋海棠高效离体快繁方法。

发明内容

本发明的目的是为了建立蟆叶秋海棠组织培养繁殖体系。

为了达到上述目的，本发明提供了一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：选取3个月左右叶龄的叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：先以适量洗衣粉溶液浸泡清洗，后用自来水反复冲洗，放入质量份数为3％的H₂O₂中浸泡3min，取出后立即转入含有2％(质量浓度)吐温-80的0.1％升汞溶液中消毒3min，再以无菌水冲洗5-6次，每次6-8min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成0.5-1cm²的方形小块。

(2)不定芽的诱导：取步骤(1)中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm²大小的方块，将叶片以远轴面接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25±2℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养15d；所述正常光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1300lx；所述诱导培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+0.5mg/L GA₃，pH值为6.0；

(3)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为5KV/cm，时间1小时；

(4)不定芽的继代增殖：将诱导得到的不定芽切割后，接入继代增殖培养基中进行继代培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述继代增殖培养基为MS+1.2mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+0.2mg/LKT，pH值为6.0；

(5)根的诱导：将步骤(4)中继代增殖得到的蟆叶秋海棠试管苗进行切割后，每株均有一个不定芽，接入生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述生根培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/LNAA，pH值为6.0；待不定跟数5条左右，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

以上所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.5g/L、蔗糖30g/L，且pH值为6.0。

(6)将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，移栽入扦插基质中，所述扦插基质为：按照3∶2∶1∶1的重量比例将马肝土、黄土、泥炭土和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0.1％的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。

对于本发明的进一步改进在于，所述步骤(1)中外植体的选取，以3个月叶龄的叶片为外植体，在诱导15后即可有效获得大量不定芽，数量多且生长迅速；