[发明专利]一种基于微流控芯片的病原体检测方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种基于微流控芯片的病原体检测方法，属于化学及生物医学领域。

背景技术

近年来，连续爆发非典、禽流感、手足口病、甲型H1N1流感。每一次严重传染性疾病的流行都给社会、经济造成了巨大的损失，给人的生命带来了极大威胁。目前常用的病原体检测方法有PCR 技术、培养技术、免疫酶技术( EIA) 、酶联免疫吸附试验( ELISA) 等。这些技术在临床诊断中已发挥了巨大的作用,但仍存在一些缺点,大多比较耗时，处理过程复杂且成本高。建立一种快速、灵敏、特异的检测病原体的方法是预防和控制传染病的重要保证。

微流控芯片技术是在一块几平方厘米的芯片上构建化学或生物实验室，将化学和生物实验中说涉及到的各种样品处理，反应，分离，检测等集成到一起，具有微型化、自动化、样品消耗量小、检测效率高等优点。磁性粒子作为一个固相载体，在靶向物质识别，分离，控制给药，分选细胞等方面具有广泛的用途。在微流控芯片上结合磁珠技术是当前研究的热点问题之一。

由于量子点具有独特又优越的光学性能,如消光系数大，量子产率高，激发光谱宽，发射光谱窄,亮度比传统的荧光染料高10-100倍，光稳定性比传统的荧光染料高100-1000倍等特点，目前已被广泛应用于生物荧光标记。

我们将微流控芯片、磁免疫分析及荧光检测相结合，建立了一种快速、高效、低耗，高特异性、高灵敏度、实时的病原体检测方法，为病原体的现场检测提供了强有力的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、高效的病原体的检测方法。

以集成微磁场的微流控芯片作为反应的容器，磁球作为固相载体，链酶亲和素修饰的量子点（SA-QDs）作为荧光标记物，在微磁场的作用下，在芯片通道中特定部位捕获磁球，形成了微反应区，通过夹心免疫反应捕获病原体，通过生物素与链酶亲和素的相互作用，实现对病原体的荧光免疫定量分析。在芯片上实现了病原体的分离、富集、免疫反应、分析检测。

具体的技术方案包括如下步骤：

（1） 集成微磁场的微流控芯片的制作：用软刻蚀的方法制得微流控芯片的阳模；将两个导磁棒固定于阳模微通道的两侧，导磁棒之间的夹角是0～180^o，导磁棒所形成的平面与微芯片的平面之间的夹角是90^o；采用原位反应成型法，将液态预聚物倒在固定导磁棒的阳模上，反应固化后，脱模成型，打进样孔和出样孔，然后与盖片键合，即得到集成微磁场的微流控芯片（如图1、2所示）；

（2） 修饰有抗特定病原体表面蛋白单抗的磁球制备：用乙基-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺（EDAC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合物活化磁球表面的羧基，然后加入抗待测病原体表面蛋白的单抗，后将连有抗体的磁球分散在含有叠氮化钠、BSA的PBS（pH 7.4）缓冲液中，保存备用；

（3） 生物素化的抗病原体表面蛋白单抗的制备：采用生物素化的试剂盒在HA单抗上修饰生物素，用脱盐柱进行纯化；

（4） 在芯片上进行磁性夹心免疫荧光反应检测病原体：首先用BSA溶液封闭芯片通道，同时在芯片的导磁棒上各放一块永磁铁，然后依次向通道中注入修饰有抗特定病原体表面蛋白单抗的磁球、特定病原体、生物素化的抗该病原体表面蛋白单抗、链酶亲和素修饰的量子点（SA-QDs），每步反应后都用PBS缓冲液冲洗通道，洗掉未反应的药品，最后通过荧光显微镜与光纤光谱仪进行荧光检测。

上述方案中：步骤（1）中制备微流控芯片的材料为弹性体聚合物如聚二甲基硅氧烷（PDMS）和热塑性材料如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）、聚苯乙烯（PS）等；制作微流控芯片用的阳模为金属基阳模、单晶硅阳模或玻璃阳模；制作导磁埲材料为氧化铁或硅钢类软磁性材料。

本发明建立了一种基于微流控芯片、磁球、量子点的简单快速检测病原体的磁性荧光免疫检测方法。将微流控芯片、磁免疫分析及荧光检测相结合，兼具了微流控芯片的快速、高效和样品用量小，磁免疫分析的高特异性、强可操纵性，及量子点优异的光学性质等优点，是一种简单、快速、高效、便携、适合于现场检测的方法。本发明可更广泛地应用于生物和医学科学等领域。

附图说明

图 1为实施例1中的 微流控芯片结构示意图，图中1.微流控芯片基片、2.微通道、3.导磁棒、4.永磁铁、5.盖片。

图 2为实施例1中的纵剖面结构示意图，图中1.微流控芯片基片、2.微通道、3.导磁棒、4.永磁铁、5.盖片。