[发明专利]一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法

权利要求书

1.一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，包括多重PCR引物设计、多重PCR矩阵扩增、凝胶电泳及图像采集和基因表达谱定量化及聚类分析。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于,多重PCR矩阵法检测包括以下步骤：

1）高度特异性引物设计、评估及合成；

2）模板制备：总RNA的提取及反转录；

3）多重PCR矩阵反应体系加样；

4）多重PCR反应；

5）多重PCR扩增产物凝胶电泳分离；

6）凝胶电泳图像采集及预处理；

7）基因表达谱定量化分析；

8）基因表达谱聚类分析，获得具有显著性差异的靶基因。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1）中的多重PCR引物包括：多重PCR引物和基因特异反转录引物；多重PCR引物用于多组具有潜在相关性靶基因表达谱的扩增及鉴定，可根据靶基因的基因组或mRNA序列设计多重PCR引物；基因特异反转录引物用于低丰度靶基因的扩增及鉴定，可根据低丰度基因的基因组或mRNA序列设计基因特异反转录引物。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述引物设计及评估可用以下软件：MPprimer、MFEprimer2.0、Primer3.0、Primer Premier 6.0、Oligo7.35和DNAman，优选为MPprimer和MFEprimer2.0。

5.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2）中模板的制备方法中，首先提取生物体细胞的总RNA，然后用基于通用引物的常规反转录法或基于基因特异性引物与通用引物的两步反转录法将总RNA反转录成cDNA；所述反转录方法优选为基于基因特异性引物和通用引物的两步反转录法。

6.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3）中的加样系统可以为：自动加样系统和手动加样系统，优选为自动加样系统。

7.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤5）中的凝胶电泳可以为：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和脉冲场电泳等常规电泳。

8.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤6）中的凝胶电泳图像采集系统可以为：目前市售的各种凝胶图像采集系统，针对多重PCR的不同扩增产物，首先采用凝胶电泳进行分离，然后用凝胶成像仪采集图像并结合图像处理软件进行图像预处理(包括图片的删减和明亮度的调节等)，最后用凝胶成像仪自带软件对不同的基因量进行灰度值分析。

9.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤7）中的基因表达谱定量化分析可以为：内标基因的相对定量法、毛细管电泳或荧光探针绝对定量法等，优选为内标基因的相对定量法和毛细管电泳绝对定量法；

所述内标基因的相对定量方法为：根据步骤6）中的凝胶电泳图像采集系统获得的目的基因及内标基因的积分光密度值取比值以界定基因表达谱的相对变化趋势；

所述毛细管电泳的绝对定量为：对多重PCR扩增产物直接进行毛细管电泳分离，然后结合荧光染料进行实时检测目的基因的表达水平，最后利用定量Marker实现目的基因表达水平的绝对定量。

10.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤8）中的基因表达谱聚类分析方法为：针对步骤7）中的基因表达谱定量化分析结果，采用生物信息学技术对不同基因进行聚类分析，具体分析过程如下：

①将步骤7）的基因表达谱定量化分析结果形成数据矩阵，每列为一个处理组，每行为一个基因，然后对基因(每一行)和样本(每一列)都进行进一步的标准化，即每个值都除以所在行或列的标准差；

②对①标准化后的矩阵进行无监督聚类分析：使用已知的R软件中分层聚类方法，对基因和处理组同时进行聚类分析；

③对①标准化后的矩阵进行显著性差异统计分析：利用R软件中SAM算法对①标准化后的矩阵进行分析，并且利用分析结果中的q-value（质量因数）对基因的显著性差异进行假阳性控制，将质量因数小于5%定义为显著性差异基因。