[发明专利]一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域和分子诊断领域中的多重PCR矩阵检测方法，特别是涉及一种集PCR引物设计、多重PCR矩阵、凝胶电泳及图像采集、基因表达谱定量化及聚类分析为一体的多重PCR矩阵检测方法及其在高通量基因表达谱检测中的应用。

背景技术

随着基因组时代的到来，基因表达调控成为分子生物学及分子诊断学领域的研究重点。目前常用的基因表达调控检测方法主要有：Southern blot、基因芯片、实时定量PCR、大规模基因测序及多重PCR等(Mukherjee et al.Intrachromosomal tandem duplication and repeat expansion during attempts to inactivate the subtelomeric essential gene GSH1 in Leishmania.Nucleic Acids Res.2011,doi:10.1093/nar/gkr494;Osamu et al.Multiplex cDNA quantification method that facilitates the standardization of gene expression data.2011,39(10):e70.doi:10.1093/nar/gkr138.Khan et al.Quantitative analysis of six gene products as candidate markers of early placental villi development in the human.Indian J Physiol Pharmacol.2010,54(4):299-308;Hua et al.Genomic profile of Toll-like receptor pathways in traumatically brain-injured mice:effect of exogenous progesterone.J Neuroinflammation.2011,doi:10.1186/1742-2094-8-42)。其中，基于多重PCR技术规模化高通量筛选靶基因表达水平的变化对微生物分类鉴定等有重要意义。虽然传统的基于基因芯片、实时定量PCR和大规模基因测序等技术能够实现基因表达水平的检测，但是由于它们存在假阳性率高、特异性差、成本高以及通常需要反转录PCR(RT-PCR)技术进行进一步验证等缺点使其大规模应用受到了一定限制。同时，近年来出现的PCR阵列技术则以实时定量PCR技术为核心并结合阵列技术(张艳春,任长虹，高艳，屈武斌，张成岗.实时定量PCR阵列技术在规模化检测基因表达中的应用.军事医学科学院院刊,2010,34(6):589-591)，能够用于检测信号转导过程、疾病相关通路等的基因表达图谱，在规模化检测基因表达方面具有一定的优势，但是却不具备高通量的特点。

发明内容

基于发明人长期从事PCR引物设计及评估、凝胶电泳及图像采集分析、基因表达谱定量化及聚类分析的多学科研究，本发明的目的在于提出了一种多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，旨在多重PCR基础上结合矩阵技术更大规模地筛选靶基因，进而进行基因表达水平定量化及聚类分析，以获得靶基因表达谱特征。

本发明提供一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，包括多重PCR引物设计、多重PCR矩阵扩增、凝胶电泳及图像采集和基因表达谱定量化及聚类分析。

所述多重PCR矩阵法检测包括以下步骤：

1）高度特异性引物设计、评估及合成；

2）模板制备：总RNA的提取及反转录；

3）多重PCR矩阵反应体系加样；

4）多重PCR反应；

5）多重PCR扩增产物凝胶电泳分离；

6）凝胶电泳图像采集及预处理；

7）基因表达谱定量化分析；

8）基因表达谱聚类分析，获得具有显著性差异的靶基因。