[发明专利]蓝藻中荧光恢复蛋白的表达纯化及其晶体结构

权利要求书

1.一种蓝藻中的荧光恢复蛋白（FRP）的晶体三维结构，其中所述蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）为蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的第26位到第134位的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1 中的坐标的平均根方差小于或等于1.7埃。

2.根据权利要求1所述的蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的晶体三维结构，其中所述蓝藻为蓝细胞PCC 6803。

3.根据权利要求1或2所述的蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的晶体三维结构，其中所述的晶体具有P4(1)2(1)2的空间群，晶胞参数为约：a=b=87埃，c=226埃，α=β=γ=90°。

4.根据权利要求1或2所述的蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的晶体三维结构，其中所述蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的晶体结构在一个晶体学不对称单位内有6个蛋白分子，其中共存在两种三维构象，第一种构象由5个α螺旋组成，其中α螺旋1包括第36位Gln到 第67位的氨基酸区段，α螺旋2包括第71位Ile到第91位Lys的氨基酸区段，α螺旋3包括第99位Ile到第Glu位氨基酸区段，α螺旋4包括第114位Ala到第118位Thr的氨基酸区段，α螺旋5包括第122位Ala到第133位Arg氨基酸区段。第二种构象由4个α螺旋组成，其中α螺旋1包括第36位Gln到第82位Ser氨基酸区段，α螺旋2包括第95位Arg到第108位Glu氨基酸区段，α螺旋3包括第113位Ala到第118位Thr氨基酸区段，α螺旋4包括第122位Ala到第133位Arg氨基酸区段，其中蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的第一种构象如图1（A），第二种构象如图1（B）。

5.构建高效表达蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的方法，对蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）全长基因进行截短，获得表达量大的重组载体，优选地对氨基端进行了10-30位的截短，更优选地截去氨基端前26位。

6.表达和纯化蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的方法，包括:

(a)构建融合了标签蛋白基因的编码蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）基因序列的载体，将重组载体转化入原核或真核细胞，进而表达带有标签蛋白的蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）；

(b)将（a）获得的FRP蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出所述目的蛋白，经过Thrombin蛋白酶在4-30摄氏度酶切过夜，优选地使用4-10摄氏度，进一步将蛋白经过一系列亲和层析柱的方法进行纯化，通过丙烯酰胺凝胶的方法检测蛋白质纯度，得到纯度较高的FRP蛋白。

7.根据权利要求6所述的表达纯化蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的方法，其中所述标签蛋白选自His、GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、特异性抗体，优选地使用His标签，所述载体含有卡那霉素选择性标记基因；步骤（b）所述的过亲和层析柱，优选地使用Resource Q离子交换层析（GE）和凝胶排阻层析(GE)，更优选地将通过Resource Q离子交换层析之后的蛋白质再一次反挂Ni-NTA亲和层析柱，其中反挂Ni-NTA亲和层析柱时，优选地补充加入NaCl至终浓度300-500Mm。

8.根据权利要求6所述的表达纯化蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

9.结晶蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的方法，包括：

(a)将表达纯化好的蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）蛋白浓缩至浓度约为15－30mg/mL；

(b)用气相悬滴法或坐滴法筛选晶体生长条件；

(c)通过seeding等方法对蛋白晶体进行优化，获得蓝藻荧光恢复蛋白（FRP）的晶体。

10.表达和纯化硒代蛋白质FRP的方法，包括：

(a)通过将FRP中的亮氨酸突变为甲硫氨酸，构建表达硒代蛋白质载体的方法；

(b)运用大肠杆菌的BL21（DE3）表达硒代蛋白；

(c)将获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出所述目的蛋白，经过Thrombin蛋白酶在4-30摄氏度酶切过夜，在将蛋白经过Resource Q离子交换层析（GE），反挂Ni-NTA亲和层析柱，凝胶排阻层析(GE)，得到纯化好的FRP蛋白。