[发明专利]蓝藻中荧光恢复蛋白的表达纯化及其晶体结构

说明书

技术领域

本发明涉及对蓝藻中荧光恢复蛋白(FRP)的载体构建，以及在大肠杆菌中的表达、纯化和结晶方法。 

背景技术

藻类和植物需要进行大量的光合作用来摄取能量，当光照太强时，藻类和植物会通过增加热量的扩散来释放多余的能量，目前对光强减弱时，藻类和植物是如何恢复光合作用的机制知之甚少，而荧光恢复蛋白(FRP)(Clémence Boulay，PNAS，2010)是参与光合作用恢复作用的关键蛋白，解析其结构对研究光合保护作用机制具有重要的科学意义。 

发明内容

本发明涉及对蓝藻中荧光恢复蛋白(FRP)的基因工程改造，具体地说是构建第26位到第134位的截短；以及蓝藻中荧光恢复蛋白(FRP)的表达、纯化和结晶方法；以及蓝藻中荧光恢复蛋白(FRP)硒代蛋白质的载体构建、表达和纯化方法，具体地说就是将FRP的81位亮氨酸突变为甲硫氨酸；以及蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)三维晶体结构在研究蓝藻光合保护作用机制中的应用。 

第一方面，本发明将蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)进行了基因工程改造，将荧光恢复蛋白(FRP)全长基因进行了截短的研究，提供了一个可以在原核表达体系中高效表达的方法，该方法包括了氮基端约20-30位氨基酸至约120-1 34位氨基酸的编码基因，更优选包括约26位至134位氨基酸。 

本发明优选地使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对以上所述蛋白以融合蛋白的方式进行表达，优选地其中所述标签蛋白选自His、 GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、特异性抗体，优选地使用His标签，其他标签均不能得到可溶性表达蛋白。 

第二方面，本发明提供了一种表达和纯化蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)的方法，该方法包括：构建融合了标签的截短的蛋白基因的重组载体，用该载体转化原核，从而表达带有标签的融合蛋白FRP，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出目的蛋白，通过加入经过Thrombin蛋白酶酶切过夜，再经过亲和层析柱初步除杂，再过离子交换层析，反挂亲和层析柱，再过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的FRP蛋白。 

优选地，其中酶切过夜温度为4-30摄氏度，优选地使用4-10摄氏度，其中酶切缓冲液优选地使用20-50mMTris(pH8.0)，100-500mMNaCl。 

优选地，其中反挂Ni-NTA亲和层析柱优选地补充加入NaCl至终浓度300-500Mm。 

第三方面，本发明提供了一种结晶上述得到的蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)的方法，所述的方法包括：将蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)浓缩至15-30mg/ml，在4-30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件，优选地使用15-20摄氏度。 

第四方面，本发明提供了衍射性能良好的FRP蛋白质晶体。 

第五方面，本发明提供了FRP硒代蛋白质载体构建的方法，具体是将FRP中的亮氨酸突变为甲硫氨酸，提供了一种可以得到蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)的晶体三维结构的方法。 

优选地，其中所述蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)中突变的甲硫氨酸包括33位，49位，56位，81位和106位5个位点，更优选地使用81位的亮氨酸。 

第六方面，本发明提供了衍射性能良好的蓝藻荧光恢复蛋白(FRP)的硒代蛋白的晶体。