[发明专利]纳米探针转染的脂肪源细胞及其在制备MRI动态示踪剂中的用途

权利要求书

1.一种用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，其主要包括：用纳米分子探针标记的从脂肪组织中利用胶原酶和酵素酶分离、筛选获得的脂肪源细胞。

2.按权利要求1所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，所述的脂肪组织选自离体的人或动物的脂肪组织，脂肪组织碎块体积为0.5-10mm³。

3.按权利要求1所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，所述脂肪组织碎块体积为3mm³。

4.按权利要求1所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，所述的胶原酶和酵素酶的浓度为0.05-0.5%。

5.按权利要求1所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，采用CD34/CD31/KDR/CD90对脂肪源细胞进行免疫荧光鉴定及流式分析鉴定。

6.按权利要求1所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，所述的纳米分子探针选自纳米铁颗粒或者纳米金颗粒或者纳米铜颗粒，颗粒大小为5-150nm。

7.按权利要求1所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，所述的纳米分子探针对脂肪源细胞的体外标记浓度为0-100μmol/ml，标记的细胞量为0-1×10⁸。

8.按权利要求7所述的用于MRI动态示踪修复血管损伤的制剂，其特征在于，所述的纳米分子探针对脂肪源细胞的体外标记浓度为20-25μmol/ml。

9.权利要求1的MRI动态示踪修复血管损伤的制剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）分离、培养、扩增及鉴定脂肪组织来源的细胞

获取离体的腹股沟及背部脂肪组织，剪碎消化过滤后，通过流式细胞分选、免疫磁珠分选及差速贴壁消化法纯化获取具有内皮祖/细胞形态特征的CD34+细胞，并进行免疫荧光鉴定及流式分析鉴定所获得的细胞的表型表达情况及细胞纯度，并向内皮细胞诱导分化；

（2）制备树状大分子功能化的纳米分子探针及功能检测

制备直径5nm的纳米铁微粒，聚谷氨酸及聚左旋赖氨酸表面壳层交联修饰，制成表面高分子壳层交联的磁性纳米氧化铁颗粒；对上述聚酰胺-胺树状大分子原材料进行表征，制得直径5nm的第五代聚酰胺-胺树状大分子，对其表面进行乙酰基修饰，合成得到树状大分子包裹的纳米氧化铁微粒SCIO DENPs；所述树状大分子包裹的纳米氧化铁微粒表面结合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽c（RGDyK）-SCIO DENPs，透射电镜测量其粒径，表面形态及分散情况，MRI检测其在琼脂糖凝胶混悬液中R2和R2*值；

（3）纳米分子探针标记脂肪源干细胞及体外MRI示踪

将扩增后的GFP小鼠脂肪源细胞与不同浓度的纳米探针共同孵育24h后，行普鲁士蓝染色，透射电镜检测纳米铁颗粒在内皮祖/干细胞中的部位，同时以每10³-10⁴个细胞接种于96孔培养板中行MTT检测，检测细胞毒性并寻找最佳的标记浓度；将标记细胞经Tμnel染色后流式检测凋亡细胞的量；分别取不同浓度标记的0.5×10⁶、1×10⁶、5×10⁶个细胞置于1.5ml Eppendorf管中，加入1ml溶解的1%琼脂糖溶液混匀，体外MRI检测标记细胞群信号强度；制得MRI动态示踪剂。