[发明专利]甲状腺过氧化物酶抗体均相发光免疫分析试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及光激发偶联免疫检测技术，具体为甲状腺过氧化物酶抗体均相发光免疫分析试剂盒及其检测方法。 

背景技术

甲状腺过氧化物酶（TPO）是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区、跨膜区和膜外区，伸向充满胶质滤泡腔的部分具有催化活性。TPO作为甲状腺激素合成过程中一种重要的酶，能催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的偶联，最终生成甲状腺素（T₃、T₄）。当甲状腺发生病变，滤泡细胞结构受到破坏时，TPO于甲状腺滤泡细胞腔的边缘即甲状腺细胞顶部向外周血溢漏，刺激机体免疫系统产生TPO抗体（anti-TPO抗体）。TPO抗体可通过激活补体系统引起甲状腺细胞损伤。因此，血清TPO抗体定量分析可用于自身免疫性甲状腺疾病的诊断、预测疾病发展等方面。 

目前有3种试剂用于TPO抗体的定量分析：酶联免疫吸附试验、酶促发光免疫分析和化学发光免疫分析。①酶联免疫吸附试验以酶标反应板为固相载体，采用传统间接反应模式：将已知抗原（TPO）吸附在固相载体上，加待测抗体, 再加酶（如辣根过氧化物酶）标记抗人IgG，最终形成抗原－待测抗体－酶标记抗体复合物；加入酶显色底物（如四甲基联苯胺），借助酶标仪测定吸光度值，待测抗体的含量与吸光度值呈正比。②酶促发光免疫分析测定原理基本同酶联免疫吸附试验。但有两点不同：其一采用微球作为固相载体；其二采用酶的发光底物。以美国德普公司（DPC）生产的TPO抗体试剂为例，采用碱性磷酸酶标记的抗人IgG作为标记抗体，使用金钢烷- 1 ,2 -二氧乙烷衍生物 (AMPPD)作发光底物。在碱性磷酸酶的作用下，AMPPD迅速脱去磷酸基团，生成不稳定的中间体AMPD，AMPD很快自行分解，从高能激发态回到低能稳定态时发出光子。这种化学发光稳定，持续时间可达数小时，容易测定，也容易控制。③电化学发光免疫分析采用三联吡啶钌或其衍生物NHS作为标记物。以罗氏公司生产的TPO抗体试剂为例，此方法以磁微粒作为固相载体包被链霉亲和素，用生物素标记TPO抗原，在反应体系内标记了三联吡啶钌的羊抗人TPO抗体与待测抗体竞争结合生物素化抗原，形成磁性微粒包被链霉亲和素-生物素化抗原-三联吡啶钌标记羊抗人TPO抗体复合物，将复合物吸入流动室，同时引入三丙胺（TPA）缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗原和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗体的浓度呈反比。患者血样中的TPOAb含量与系统所检测的相对光单位(RLUs)数量呈正比关系，根据标准曲线可以算出患者血样中的TPOAb浓度。 

酶免疫分析检测甲状腺过氧化物酶抗体的主要优势表现在：检测试剂已实现国产化、酶标仪普及程度高；因此，酶免疫分析具有较低检测成本，能够在基层医院开展工作。但是，由于采用酶作为示踪物质，稳定性较差且酶活性干扰因素较多，导致酶免疫分析的精密度不够理想。此外，酶免疫分析采用微孔反应版作为固相材料，微孔内用于包被抗体面积有限，不能包被足够的抗体，不能实现理想检测范围。化学发光免疫分析是目前检测性能较高标记免疫分析技术，具有较高的自动化水平，较高的检测性能（敏感度、精密度、稳定性等方面）。但是，化学发光检测仪比较昂贵，且检测试剂依赖进口，从而使检测成本很高，基础医疗单位很难开展。 

此外，现有TPO抗体检测方法或诊断试剂仍然存在以下两个方面的缺陷。 

第一：非均相免疫分析模式带来的固有缺陷 

就标记免疫分析原理而言，上述三种诊断试剂均属于非均相免疫分析模式。未与待测物质结合的游离状态标记物，和与待测物质结合的结合状态标记物中示踪剂特性完全相同，测定前必须去除游离状态标记物，通常测定结合状态标记物才能反映抗原抗体反应的强度。非均相免疫分析采用固相吸附法分离结合标记物和游离标记物。固相吸附分离法是将抗原（抗体）吸附在固相载体表面，使免疫反应在固相载体表面上进行，待测物质（抗体或抗原）、标记抗体（抗原）均可通过免疫反应结合在固相材料表面，未结合物质（含游离标记物）存在于液相中。此时，弃去液相并经洗涤，便可去除游离标记物。一般情况下，酶免疫分析采用酶联免疫反应板作为固相材料，发光免疫分析采用磁性微球作为固相材料。