[发明专利]一种微生物产γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）T-C2，尤其涉及利用该微生物发酵生产的γ-谷氨基甲酰胺合成酶来催化合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

L-茶氨酸（L-Theanine）是茶树中特有的非蛋白质游离氨基酸，它是茶叶中主要的品质与功能成分之一，因其具有安神镇静、免疫调节等多种生理作用而广泛应用于食品、药品及饲料添加剂等领域，并于2002年被美国健康食品行业评为最具潜力的天然产物之一。

L-茶氨酸的天然来源途径极少，茶树体内的L-茶氨酸是以谷氨酸和乙胺为底物，在茶氨酸合成酶的作用下形成的，它与茶树氮代谢有密切关联。目前其制备主要包括从茶叶中直接分离纯化、化学合成和生物合成等几种方法：

（1）分离纯化：由于茶叶中还存在其他较高浓度的可溶性物质，如咖啡因和茶多酚等，那么针对现阶段的研究，最为关键的难点在于如何分离纯化得到高纯度L-茶氨酸。

（2）化学合成：茶氨酸化学合成提供了一种简单、方便、廉价的生产方法。但是化学合成会产生较多副产物，而且得到的产物是L-构型与D-构型的消旋体，同时反应时间较长、污染大，经济效益不够理想。

（3）生物合成：从产品加工成本、产品安全性以及产品质量等方面考虑，生物合成是制备L-茶氨酸的发展趋势。目前，国内外L-茶氨酸生物合成主要包括茶树细胞悬浮培养、茶树愈伤组织培养、及微生物酶促合成等方法。现在国外L-茶氨酸生物合成主要采用微生物酶促合成法生产。

合成L-茶氨酸的微生物酶的研究主要集中于谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰基转肽酶和γ-谷氨基甲酰胺合成酶四种。上述四种微生物酶均具有γ-谷氨酰基转移功能，即在适宜条件下皆能将谷氨酰基转移给乙胺而合成L-茶氨酸，但合成机制有所不同。其中，谷氨酰胺转肽酶合成途径须以谷氨酰胺和乙胺为底物，而其他三种则可以谷氨酸和乙胺为底物，偶联酵母发酵作为ATP产生系统，就能合成L-茶氨酸。由于谷氨酰胺市价过高，且相比谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶，γ-谷氨基甲酰胺合成酶对乙胺具有较高的亲和力，反应中不产生副产物谷氨酰胺，使得其成为L-茶氨酸酶促合成的主要研究方向。

由此可见，就目前L-茶氨酸的市场关注度和需求量而言，寻找一种能够生产合成L-茶氨酸的微生物γ-谷氨基甲酰胺合成酶，并建立γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法对其产业的未来发展具有重要的理论意义和实践价值。然而，因受到研究方法与技术手段的限制，对γ-谷氨基甲酰胺合成酶的酶源筛选、培养与固定化及其酶促合成L-茶氨酸等关键技术难点，国内外目前尚未取得突破性进展。因此，开展微生物产γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的研究已成为当前L-茶氨酸制备的热点问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）T-C2，同时还提供利用该近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）T-C2发酵生产的γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法。

本发明的近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）T-C2，已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012232，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

本发明菌株近玫色锁掷孢酵母T-C2，菌落呈玫粉色，形态呈卵圆形凸起，不透明，表面光滑，边缘平整，菌体粘稠，易挑起，菌体多呈椭圆形或球杆状有锁状联合，年幼的菌落中可生出茁芽；经生化检测发现，糖发酵、硝酸盐还原和类淀粉物质的生成试验均呈阴性，脲酶试验呈阳性；经分子生物学鉴定，获得555 bp序列，BLAST比对分析表明，该菌株与近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）最为接近。

参照《真菌鉴定手册》、中国真菌志及酵母菌各属检索表，按J·Lodder 酵母分类学鉴定进行分析，由检索表将其归为近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。