[发明专利]深静脉血栓易感性检测试剂盒（MTHFR等基因）

说明书

技术领域

本项目属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种与深静脉血栓形成易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估深静脉血栓发病的风险级别，并作为预防和治疗深静脉血栓的方向指导。

背景技术

深静脉血栓是血栓性疾病的一种，成为近年来严重威胁人类健康的医学问题之一。我国人群年发病率约为1/1000，且无性别和年龄差别，是骨折、大手术病人、肿瘤及其他慢性病患者的主要合并症。深静脉血栓的形成机制很复杂。随着分子生物学的发展，一些血栓易感基因成为研究热点，这其中包括内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein Creceptor，EPCR）、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetra-hydrofolate reductase, MTHFR)和血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)。

EPCR是Fukudome 等在1994年发现的蛋白 C 系统的一个新成员，主要表达于大血管的内皮细胞上。目前为止已发现EPCR存在多种基因突变或多态性。其中外显子4的多态性（A6936G）与深静脉血栓形成有很大关系。当EPCR基因6936位点上的碱基A突变成G后，导致 EPCR蛋白跨膜区 219 位点由丝氨酸（Ser）变为甘氨酸（Gly），而变异体中的这些残基将导致 Gly-Gly 配对，可能改变跨膜螺旋。基因突变的结果导致EPCR 从细胞膜上脱落下来形成可溶性 EPCR (soluble endothelial cell protein C receptor, sEPCR)。sEPCR 水平增高的与血栓形成患病率增高有关，是白种人静脉血栓形成的危险因素之一。

MTHFR是同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶，能催化同型半胱氨酸转化成甲硫氨酸。MTHFR基因突变其代谢活性下降，从而导致血管舒缩因子平衡紊乱, 形成深静脉血栓（特别是儿童）。MTHFR基因内存在着十多种多态性，最常见的则是C677T多态性。由于MTHFR基因677位点碱基C突变成了T，导致该位点的氨基酸由丙氨酸（Ala）突变成了缬氨酸（Val），从而增加了一个新的限制性酶切位点。丙氨酸是MTHFR活性中心的重要氨基酸，其被缬氨酸替代则使酶的活性和耐热性都大大下降。该位点的3个基因型CC、CT和TT中TT的活性最低，约为CC基因型的45%。因此，MTHFR基因第677位点的TT基因型多态性与深静脉血栓形成有关。

ACE是肾素-血管紧张素系统(renin-agiotensin system，RAS)中的关键酶，而RAS在维持机体纤溶平衡中具有重要的意义。ACE基因的16内含子处有一段287bp的插入/缺失（I/D）多态性。ACE 基因 I/D 多态性与循环及组织 ACE 水平密切相关。经研究发现，具有 ACE 基因 DD 型的个体，其血浆 ACE 水平较高，而 II 型个体血浆 ACE 水平较低。与等位基因I相比，DD 型个体静脉血栓形成危险显著增高。因此ACE 基因 I/D 多态性与静脉血栓形成过程关系密切。

综上所述，鉴于EPCR基因、MTHFR基因以及ACE基因在深静脉血栓形成中有着不可忽视的作用，可以通过疾病易感基因检测及时筛查出易患深静脉血栓的高危人群，从而有针对性的预防和治疗，这对于降低深静脉血栓的发病率有非常重要的意义。 

发明内容

基于EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、ACE基因上I/D (rs4646994)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估深静脉血栓发病风险级别，本发明提供一种深静脉血栓基因无创检测试剂盒。

该试剂盒包括：

检测EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、ACE基因上I/D (rs4646994)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；

PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O等）；

PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O等）；

DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等）。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul。