[发明专利]黄柄鹅膏与共生植物室内共生关系的建立方法

权利要求书

1.一种黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，其特征为，利用黄柄鹅膏（Amanita flavipes）子实体诱导菌丝体，对菌丝体进行扩繁；利用野外采集的滇青冈(Cyclobalanopsis glaucoides )种子培养无菌苗及盆栽苗，将已扩繁的菌丝体分别接种到无菌苗及盆栽苗根部，室内建立共生关系，主要包括下列步骤：

（1）黄柄鹅膏菌丝体的诱导及培养：野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.08～0.16cm²的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，培养温度为22～23℃，暗培养14～18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53～60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基进行扩大培养；

（2）滇青冈无菌苗的培养：于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于0.1% HgCl₂溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6～8次；将处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基，每瓶接种1颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养8～10天后生根开始萌发，转入2000～2500Lux的光照下相同温度再培养5～8天，长出1.8～2.3cm高的小苗时进行菌丝接种； 

（3）滇青冈盆栽苗的培养：将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒2～3天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度约3～4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9：00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7：00左右将其移至室内保温；约25～30天种子发芽，待59～63天小苗长至4～5片真叶、高4～6cm时进行接种。

2.根据权利要求1所述的黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，其特征在于步骤（1）中的诱导培养基为：马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、NH₄NO₃ 0.30～0.40g/L、谷氨酸 0.28～0.32 g/L、V_B1 0.10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂11.00g/L，控制PH值为5.4左右；扩大培养基为：马铃薯100.00～120.00g/L、葡萄糖9.00～12.00g/L、滇青冈腐叶干粉（过80～100目分样筛）30.00～50.00g/L、生境土干粉（过80～100目分样筛）60.00～80.00g/L、蛋白胨 3.00～5.00 g /L、NH₄NO₃ 0.60～0.80g/L、6-BA1.20～1.50mg/L、麦芽汁200～230 ml/L、琼脂6.00～8.00 g/L，控制PH值为5.4左右。

3.根据权利要求1所述的黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，其特征在于步骤（2）中的滇青冈种子萌发培养基为：MS培养基，无糖，6-BA 1.00～1.50mg/L，NAA 0.08 ～0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80。

4.根据权利要求1所述的黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，其特征在于步骤（2）中的菌丝体接种方法为：将前面培养皿中扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的6个菌丝块围绕培养瓶中的无菌小苗按6个方向等距接种，接种瓶苗于22～23℃下培养13～16天，菌丝长满培养瓶，小苗高3.0～3.5cm，叶3～5片，总体上接种小苗比未接种小苗，茎杆粗状、叶色浓绿、叶片多（未接种小苗形成8.0～9.0cm的高茎杆小苗，茎长叶少），表明建立了黄柄鹅膏菌丝与无菌小苗的共生关系。

5. 根据权利要求1所述的黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，其特征在于步骤（3）中的菌丝体接种方法为：将前面培养皿中扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将花盆中的土轻轻翻开露出根部，将截取的菌丝块围绕根部接种（每苗接种10～15块），盖上泥土及腐叶，置于室外光照较好、空气清洁处培养，每隔13～15天，接种一次，共接种五次，118～122天，植株高10.0～13.0cm，叶子9～11片，接种小苗比未接种小苗，植株及根系生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，表明建立了黄柄鹅膏菌丝与盆栽小苗的共生关系。