[发明专利]下调锌指蛋白A20表达的siRNA及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及小干扰RNA分子及其用途，特别是能够下调锌指蛋白A20的小干扰RNA（siRNA）分子，以及所述siRNA分子用于下调锌指蛋白A20、促进树突状细胞成熟和用于制备治疗急性髓性白血病的免疫细胞或药物的用途。 

背景技术

急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一类我国常见且预后很差的恶性血液病肿瘤，目前仍有大量病人对常规治疗（化疗，造血干细胞移植，生物靶向治疗等）不敏感或治疗后复发，其中白血病微小残留病灶（Minimal residual disease，MRD）是治疗复发的主要障碍^［1-2］。近年来，肿瘤的细胞免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式，并以安全有效，副作用小等优点逐渐被广大的医务工作者和患者认可^［3］。目前认为AML病人在化疗或者造血干细胞移植治疗后，辅以特异的个体化生物免疫治疗，有利于抑制或者消除残留白血病（MRD），延缓复发，取得良好的预后^［4］。在AML细胞生物免疫治疗中，以树突状细胞（Dendritic cell，DC）递呈肿瘤抗原诱导机体特异性抗肿瘤免疫的肿瘤生物治疗已成为目前临床试验研究的热点。 

树突状细胞(Dendritic cell,DC)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，具有摄取、加工抗原，以MHCⅠ、Ⅱ类肽结合物的形式递呈抗原并促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着极其重要的作用。随着对DC摄取、递呈抗原机理的不断认识，DC培养方法的不断成熟和完善，针对肿瘤的弱免疫原性、抗原调变现象、MHC分子下调或缺失、抗原加工递呈障碍等免疫特点而设计的DC疫苗已成为该领域的热点之一。这些发展为开辟肿瘤的生物治疗新途径奠定了理论和实验基础。目前应用比较多的是DC主要来源于正常细胞，即供者正常外周血和病人治疗缓解期正常造血状态下分离的DC细胞。但是正常细胞（包括供者）来源的DC也存在诸多不足：1：来源较少，不能满足临床需要；2:制备过程中需要抗原负载 步骤；3:容易引发迟发型超敏反应等问题^［5-6］。有研究者发现了AML病人本身的AML肿瘤细胞也能诱导出DC样的细胞（即AML-DC），并应用于临床，因此我们进行生物免疫治疗所采用的细胞也包括AML-DC。 

AML-DC的发现：1998年奥地利学者Oehler在研究粒细胞分化过程中发现在较高纯度的乳铁蛋白存在的条件下，晚幼粒细胞的发育途径可以发生逆转，在GM-CSF、IL-4和TNF-α存在的条件下，颠倒粒细胞成熟路径可以产DC样细胞，具有DC细胞的形态和表型，甚至有抗原递呈能力^［7］。这为我们提供了利用髓性肿瘤细胞诱导分化产生DC的机会。近些年来研究的比较成功的是CML-DC和AML-DC^［8］。CML-DC成熟度较高，能有效刺激同种异体T淋巴细胞反应，并在临床中有了一定的应用^［9］。通过体内扩增AML-DC，发现其表型和功能存在缺陷，并且分化不够彻底，去除诱导剂后会发生逆转，不成熟的DC会诱导免疫耐受。但是AML-DC具有来源丰富，不需要抗原负载和安全性高等优点，因此具有潜在的应用前景^［10］。 

如何能够弥补AML-DC缺陷，使之应用于临床，应用的较多的有在培养过程中加入CD40配体，SCF，Ca2+等，但是由于AML-DC存在个体差异较大，没有一种方法能够做到简单适宜通用，如何更有效的促进DC细胞的成熟，是亟待解决的技术问题^［11-13］。 

A20（tumor necrosis factor,alpha-induced protein3,TNFAIP3）是一种具有锌指结构的泛素修饰酶，它有两个泛素编辑区(Two ubiquitin-editing domains)：N末端去泛素化酶保护受体相互作用蛋白（RIP）免于降解；C末端泛素化连接酶促进RIP降解（A20结构见图1）^［14］。这使得A20具有两种不同的生物学效应，即是否泛素化来调节许多关键分子的降解^［15］。近年来的研究表明A20能够通过抑制TNF和TLR（Toll-like receptor）这两条激活途径来影响NF-κB生物活性。其主要机制如下：