[发明专利]一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学研究领域，涉及隐睾特异性生精细胞模型的制备方法。

背景技术

睾丸是男性主要性器官，其功能是产生精子，精子与卵子结合，形成新的个体。隐睾是指男婴出生后单侧或双侧睾丸末降至阴囊而停留在其正常下降通路之任何一处，是最常见的男性生殖器先天性畸形之一，近年来其发病率呈上升趋势，其分子生物学机制至今尚未明确。隐睾患者常见的并发症之一是成年后生育功能异常。双侧睾丸未降者如果未进行早期干预，大多数成年后都会引起男性不育；但即便对隐睾患儿进行了早期干预如双侧睾丸固定术后，仍有约19%的病例成年后发生不育，提示在此病理过程中除了阴囊提供的适宜的微环境因素之外，单独的早期睾丸固定术不足以完全恢复隐睾患儿睾丸的生精功能,其病理过程还涉及其他的在生精过程中发挥作用的分子和遗传学因素，而针对这些分子和遗传学因素进行研究并寻找合适的治疗靶点是探索治疗隐睾性不育的重要途径。

研究对象的局限性往往限制了研究的进展。由于伦理的限制和实验技术的制约，以上这些发育早期和生殖相关的基因研究很难在人体上进行。细胞生物学的飞速发展有望克服这个领域的研究对象的局限性，为之提供理想的细胞模型。2007年，具有胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES细胞）样特性的可诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞）的出现，利用相应的疾病特异性的细胞模型研究该疾病发生和发展的分子机制及其干预措施，具有研究周期短、细胞易于培养和扩增、细胞水平上易于进行基因干扰或过表达以研究该基因的功能等优势，正成为研究者手中的有力工具。ES细胞具有2个特性：自我更新和多向分化潜能,在相应条件下具有分化成机体三个胚层各种细胞的潜能，自建系以来除了为再生医学提供种子细胞,利用其体外的分化过程模拟人类胚胎早期发育并对其进行研究也一直受到关注。在ES研究的基础上，通过向体细胞中导入OCT4、SOX2、KLF4、CMYC4个转录因子，体细胞可被重编程为iPS细胞，其特征类似于ES细胞。人的iPS细胞的成功诱导后，建立携带有人类疾病的遗传背景的疾病特异性的iPS细胞系作为研究该疾病的细胞模型，引起了生物和医学领域的广泛关注，是研究相应疾病的分子机制和治疗方法的重要工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供一种隐睾特异性细胞模型的制备方法。

为此，本发明提供了一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法，包括下列步骤：

a)收集隐睾患者新鲜尿液，离心沉淀种子细胞；

b)细胞加入种子细胞培养液，培养；

c)iPS细胞的建立和鉴定；

d)iPS细胞体外诱导分化为生精细胞。

在优选实施例中，所述种子细胞培养液为

A．Keratinocyte-SFM+supplement(BPE20ng/ml,EGF10ng/ml)+1%L-glutamine+1%P/S

B．330ml DMEM(H-G)+110ml F-12nutrient mixure+50ml FBS+5ml L-glutamine+5ml P/S+Hydrocortisone(0.4ug/ml)+EGF(10ug/ml)

上述A和B两种培养液，以体积比2:1混合即为最终培养液。

在优选实施例中，所述iPS细胞的建立为通过将OCT4、SOX2、KLF4、CMYC4个转录因子导入种子细胞，接种在辐照后的饲养层细胞上，每天更换人胚胎干细胞培养液，将出现的集落样生长的细胞用机械法挑出克隆，所述人胚胎干细胞培养液为DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+4ng/ml bFGF。

在优选实施例中，所述iPS细胞体外诱导分化为生精细胞步骤为基础诱导液为DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加1Mm L-Glutamine，第一阶段诱导因子为BMP4，其作用浓度为100ng/ml，作用时间为1周；第二阶段诱导因子为FGF9，其作用浓度为50ng/ml，作用时间为2周；第三阶段诱导因子为RA，其作用浓度为1Um，作用时间为1周。

本发明方法具有以下突出优点和特点：一，所选种子细胞为来源于尿液的细胞，其取材方式完全无创，易于被患儿接受，对于研究儿科疾病尤为重要；二，从尿源性细胞得到的iPS细胞通过各种鉴定，证实其具有和ES细胞类似的特性，可体外诱导分化为生精细胞，为研究隐睾发病的分子机制和药物筛选提供了实验平台。

附图说明