[发明专利]稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit分子标记

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记引物，以及利用所述引物检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记方法。

背景技术

水稻是重要的粮食作物之一，而稻瘟病是世界分布最广、为害最严重的水稻病害之一，己成为水稻高产、稳产的主要障碍因素（Ou S H.1980,Pathogen variability and host resistance in rice blast disease.Ann Rev Phytopathol.18:167-187.），它造成的危害正严重威胁着人类的粮食安全。防治稻瘟病也同其他水稻病害一样，是通过利用杀菌剂，栽培措施与种植抗病品种相结合的方式进行的，而种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的办法之一。然而要卓有成效地开展抗病育种工作,除了必须寻找优良的抗源外,还必须深入研究稻瘟病菌的致病机制以及水稻与稻瘟病菌之间的互作机理等，而且在病原菌与寄主协同进化过程中，病原菌毒力基因组成会随着寄主抗病基因组成的变化而改变，最终导致抗病品种抗性的丧失（Zeigler R S.1998,Recombination in Magnaporthe grisea.Annu Rev Phytopathol,36:249-275.）。在分子水平上研究这种互作关系，不仅要不断发现和利用新的抗病基因，进行水稻品种抗病基因分析，将多个抗病基因混合使用外，同时也必须对稻瘟病菌群体中的无毒基因进行分析。对无毒基因产物的研究是进一步了解特异性的分子遗传机制的重要手段，无毒基因可以作为一种分子探针用于研究稻瘟病菌的毒性群体结构特征，揭示其变异规律及动态，也可为抗病品种的合理布局和培育抗病品种及病害防治提供理论依据，从而达到长期、有效地控制该病害的目的（石军等，稻瘟病菌无毒基因研究进展.中国生物工程杂志,2006,26(12)：112~116）。

按照传统稻瘟病菌毒性组成（生理小种）鉴定的方法是通过鉴别品种的致病型鉴定划分生理小种来研究稻瘟病菌的群体结构，通过这种方法可了解稻瘟病菌群体中的生理小种组成和优势种群的变化,从而掌握稻瘟病菌的群体结构和遗传变异动态，但划分的生理小种常因鉴别品种而异，且工作量大，结果易受季节限制，环境条件人为因素的影响，难以准确反映稻瘟病菌的群体结构（陈庆河，稻瘟病菌群体遗传多样性及其无毒基因的遗传分析与分子标记定位.2005.南京农业大学博士学位论文）。

随着分子遗传学和分子生物学的发展，DNA水平上的指纹分析技术（如，SSR，RAPD，CAPS）为研究稻瘟病菌群体无毒基因的组成提供了高效、快速的方法，避免了通过鉴别品种的致病型鉴定的大量工作，因此国内外都非常重视稻瘟病菌无毒基因的分子标记筛选工作。目前利用DNA分子标记已鉴定了40多个稻瘟病菌的无毒基因(Ma,J.H.,Wang,L.,Feng,S.J.,Lin,F.,Xiao,Y.,and Pan,Q.H.2006.Identification and fine mapping of AvrPi15,a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea.Theor Appl Genet113:875-883.)，并已经克隆到了9个无毒基因（Pw11、Pw12、Avr-CO39、Avr-pita、ACE1、Avr-Pia、Avr-Pii、AvrPiz-t和Avr-Pik)，这就为通过分子标记来鉴定毒性组成创造了便捷条件。一些无毒基因连锁的分子标记（尤其是早期定位所用的分子标记）大多是RFLP标记，但由于这类标记需要复杂的操作程序、昂贵的生化试剂和大量样本的DNA，不便于无毒基因的毒性组成分析。近年来，越来越多种类的生物基因组序列公布出来，使得分子标记的发展迅速。

本研究采用的CAPS标记（酶切扩增多态性序列，Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)是基于RFLP标记发展而来，由特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生。当SCAR或STS的特异扩增产物的电泳谱带不表现多态性时，可以用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。它揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，目前已经在分子生物学、遗传学、育种学等研究领域得到广泛应用。CAPS是一种基于PCR技术的分子标记，具有共显性、位点特异性、重复性好、操作简单和成本低等特点,是一种值得推广的标记手段，有助于揭示大田中无毒基因的变异规律及动态，能大大增加目标染色体区段的PCR标记饱和度，加快无毒基因的克隆工作。

发明内容