[发明专利]一种生物法合成异戊二烯醇的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌菌株，其包含：

(1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段或分别与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；

(2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶具有70％以上同源性的核酸分子；

(3)编码枯草芽孢杆菌焦磷酸酶的基因片段，或与枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子。

2.一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备包含羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性的核酸序列的重组质粒A；

(2)将重组质粒A与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸序列连接成重组质粒B；

(3)制备包含甲羟戊酸激酶基因片段、磷酸甲羟戊酸激酶基因片段和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因片段和或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶具有70％以上同源性的核酸分子的重组质粒C；

(4)制备包含焦磷酸酶基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子的重组质粒D；

(5)将重组质粒B、C和D共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得含有三种重组质粒的工程重组大肠杆菌菌株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述重组质粒B、C和D分别包含与表达调控元件可操作地连接的不同的抗生素抗性基因片段。

4.一种合成异戊二烯醇的方法，该方法包括将权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊二烯醇的产物。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其中所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶分别由来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA还原酶基因mvaE编码。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶分别由来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，甲羟戊酸磷酸激酶基因ERG8和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1编码。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述焦磷酸酶由来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的焦磷酸酶基因BsNudF编码，或由来源于其它生物体的与所述枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因同源性超过70％的核酸分子编码，或由与枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子编码。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于所述碳源是可再生糖类，如水解生物质，包括甘蔗渣、玉米秸秆、木浆、转化糖，以及单糖、二糖、多糖等。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述焦磷酸酶基因在所述大肠杆菌中过量表达。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述重组大肠杆菌是保藏号为CGMCC No.5746的大肠杆菌菌株。