[发明专利]一种生物法合成异戊二烯醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及异戊二烯醇化合物的生物合成，具体地涉及一种重组大肠杆菌工程菌株、该工程菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株合成异戊二烯醇的方法。 

背景技术

异戊二烯醇(Isoprenol)又名3-甲基-3-丁烯-1-醇，甲基-3-丁烯-1-醇是一种重要的有机合成中间体，可用于合成聚羧酸类混凝土减水剂以及低毒、高效的拟除虫菊醋杀虫剂。合成MBOH的传统工艺为在SnCl₄，ZnCl₂等催化剂作用下，异丁烯与甲醛经PrinS缩合反应得到。该工艺使用的催化剂对设备腐蚀严重且不易与产物分离，污染环境。固体碱、离子液体和分子筛等催化剂可用于Prins缩合反应，能有效解决上述问题。耿艳霞等以叔丁醇为溶剂，采用固体碱催化异丁烯与甲醛进行Prins缩合反应，在200℃下反应4h，甲醛转化率达到90％，异戊二烯醇选择性为92％。宋河远等(宋河远，唐中华，陈静.功能化酸性离子液体催化甲醛与烯烃的Prins缩合反应.分子催化，2008，22(5)：403-407)以离子液体为催化剂考察了异丁烯与甲醛水溶液的Prins缩合反应，在80℃、5MPa下反应5h，甲醛转化率为51.8％，对4，4-二甲基-1，3-二氧六环的选择性为45.9％。目前用于合成MBOH的分子筛催化剂主要有ZSM系列分子筛。但与均相氯化物催化剂相比，分子筛催化剂的反应活性较低，如采用ZSM系列分子筛催化剂，在102℃、1.0MPa下反应7h，甲醛转化率仅为58.2％，烯醇(异戊二烯醇及其异构体)的总选择性为79.8％，而且催化剂的稳定性较差，不能用于工业化生产。 

因此，为这种有价值的化合物的生产提供更有效更绿色的方法将是本技术领域的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊烯醇和异戊二烯醇。工程大肠杆菌具有生长速度快、发酵周期短、遗传背 景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此工程大肠杆菌作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而再利用MVA途径的终产物二甲基丙烯基焦磷酸作为直接前体来转化生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。MVA途径首先在甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用下利用糖来合成甲羟戊酸，然后甲羟戊酸再在甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的作用下转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)，IPP再在异戊烯基焦磷酸异构酶的作用下转化为二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。 

Wither等鉴定了一种来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶基因，并通过体内和体外反应进行了其功能，发现其能够水解IPP和DMAPP生成异戊烯醇和异戊二烯醇(Wither et al，2007)，但没有对其底物特异性进行研究，也没有对异戊烯醇和异戊二烯醇生产途径进行优化。但是，为了特异性生产异戊二烯醇，需要对烯醇生物合成途径进行代谢工程改造，该发明首次通过表达部分MVA途径，即不表达异戊烯基焦磷酸异构酶来特异性合成IPP，阻止IPP到DMAPP的转化，以尽量避免产物中引入3-甲基-2-丁烯-1-醇等杂质。 

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明主要通过代谢工程改造甲羟戊酸途径(MVA途径)，特别是过量表达来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶，从而在工程大肠杆菌中实现了选择性生产异戊二烯醇单一组分。通过该方法，获得了产物纯度超过99％以上的异戊二烯醇，实现了异戊二烯醇的高特异性生产。 

因此，在第一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株，其包含： 

(1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段或分别与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸分子； 

(2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸 脱羧酶具有70％以上同源性的核酸分子； 

(3)编码焦磷酸酶的基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子。 

在第二个方面，本发明提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤： 

(1)制备包含羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性的核酸序列的重组质粒A；