[发明专利]核酸的扩增检测方法以及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于对核酸进行扩增、检测所扩增的核酸的方法以及试剂盒。

背景技术

为了使用PCR对DNA进行扩增，需要以作为靶标的核酸为其一对间的区域的引物核酸、聚合酶、作为该聚合酶的底物并形成扩增后的核酸的核苷三磷酸。扩增后，使用任意的方法，例如使用具有与靶序列互补的序列的特异性探针核酸，能够检测作为靶标的核酸。

另外，还有使用逆转录(RT)PCR对cDNA进行扩增的方法，此时，可以利用具有逆转录活性的聚合酶。

而且，为了防止扩增产物的污染，已知有使用作为非天然型核苷三磷酸的脱氧尿苷三磷酸的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)法(专利第3392863号)。

但是，在这样的现有技术中，一般存在如下问题，(1)具有逆转录活性的聚合酶的种类受限制；(2)一般的聚合酶大多不摄取作为扩增时的底物的脱氧尿苷三磷酸，有时不能利用UNG法中的尿嘧啶N糖基化酶进行分解，不能防止污染；(3)扩增的速度优选较快。

这样，期待一种能够进行逆转录、能够使用脱氧尿苷三磷酸的迅速对长链的靶核酸进行扩增及检测的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够进行逆转录、能够使用脱氧尿苷三磷酸、能够防止合成的核酸链分解、迅速对长链的靶核酸进行扩增及检测的方法。

本发明人发现，将序列编号1中的第653位的脯氨酸取代为谷氨酸的Tth聚合酶具有逆转录活性，能够摄取脱氧尿苷三磷酸，而且通过使序列编号1中的第1～77位或者第1～291位的氨基酸缺失，能够降低5’→3’核酸外切酶活性，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种对试样中所含的核酸进行扩增的方法，该方法包括：

(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，与含有该核酸的试样混合的工序；以及

(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序，

其中，该聚合酶具有由序列编号1构成的氨基酸序列或者与序列编号1同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的653位的氨基酸残基被谷氨酸取代。

(2)一种对试样中所含的核酸进行扩增并检测的方法，该方法包括：

(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及用于检测所扩增的核酸的探针，与含有该核酸的试样混合的工序；

(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序；以及

(c)使用该探针检测该区域的工序，

其中，该聚合酶具有由序列编号1构成的氨基酸序列或者与序列编号1同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的653位的氨基酸残基被谷氨酸取代。

(3)根据(2)中所述的方法，其中，所述(c)的检测工序通过扩增反应中蓄积的PCR产物的检测或者熔解曲线分析而进行。

(4)根据(1)至(3)中任意一项所述的方法，其中，所述进行扩增的核酸为DNA或RNA。

(5)根据(4)中所述的方法，其中，所述(b)的扩增工序为PCR或RT-PCR。

(6)根据(1)至(5)中任意一项所述的方法，其中，所述作为核酸扩增底物的核苷酸含有脱氧尿苷三磷酸。

(7)根据(1)至(6)中任意一项所述的方法，其中，所述聚合酶是，为使5’→3’核酸外切酶活性缺失或降低而使N末端的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。

(8)根据(7)中所述的方法，其中，所述聚合酶为序列编号1的氨基酸序列中的第1～77位的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。

(9)根据(7)中所述的方法，其中，所述聚合酶为序列编号1的氨基酸序列中的第1～291位的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。

(10)根据(1)至(9)中任意一项所述的方法，其中，所述(b)工序为在20个碱基以上/秒的条件下对核酸进行扩增的工序。

(11)根据(10)中所述的方法，其中，所述(b)工序为扩增600个碱基以上的碱基长度的工序。

(12)一种试剂盒，其用于对试样中所含的核酸进行扩增，该试剂盒含有：用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，其中，

该聚合酶具有由序列编号1构成的氨基酸序列或者与序列编号1同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的653位的氨基酸残基被谷氨酸取代。