[发明专利]快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法。

【背景技术】

葡萄(Vitis vinifera L.)，葡萄属（Vitis）落叶藤本植物，几乎占全世界水果产量的四分之一，其营养价值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒。近年来，“法国悖论”的科学发现引起人们对葡萄中生物活性物质的广泛关注。研究表明，葡萄中富含白藜芦醇、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸等酚类和类酚类生物活性物质，具有重要药理功能和生物活性，具有良好的保健作用，尤其是白藜芦醇具有抗癌的活性而受到市场的青睐。

随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄或其他替代植物中来源的生物活性物质已不能满足需要。植物细胞培养是生物技术领域里的一个重要分支，因其具有生长速度快、周期短、不受季节影响、产物均一可控、药效成分高于天然植物等优点，采用大规模植物细胞培养是解决药用植物资源匮乏及药效成分低的药用植物满足需求的重要途径。近年来，植物细胞培养进行有效成分的生产已经取得了令人瞩目的成就，而葡萄细胞培养生产次生代谢产物（如白藜芦醇）的研究还处在实验室的研究阶段，进入中试和大规模培养还亟待解决如细胞株的筛选、细胞系的长期继代保持、悬浮细胞系的建立和诱导子调控效率等诸多问题。为了解决这些问题，目前最关键的技术是建立快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法，但目前葡萄自然来源的外植体由于容易受到污染率和消毒剂的影响，存在愈伤组织诱导效率低，形成愈伤组织质量差，不能长期继代保持等问题，导致葡萄细胞培养生产次生代谢产物的研究进行缓慢。直至目前，以葡萄叶片、叶柄、茎段等为外植体进行愈伤组织诱导取得了一定的进展，但以无菌株系小苗茎段和叶片诱导愈伤组织，并进行继代增殖以获得松散型愈伤组织、及对该松散型愈伤组织长期继代保持的方法还鲜有报道。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，并揭露了将所获得的葡萄松散型愈伤组织进行保持的方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，其包括如下步骤：

（1）葡萄无菌株系的获得：选取经预处理后的当年生无病葡萄枝条的带节茎段，之后将所选取的带节茎段接种到附加0.1mg/L NAA的1/2MS培养基上诱导产生葡萄无菌株系；其中预处理包含清洗、风干表面水分，并杀菌消毒；

（2）启动培养：取步骤（1）所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0.5cm茎段或切取0.5cm×0.5cm见方大小的叶片作为外植体，接着将该外植体接种至诱导愈伤组织的培养基中，并将该培养基置于培养室中培养，7天后可见愈伤组织形成，25~30天后长成初代愈伤组织；

（3）制备葡萄松散型愈伤组织：将步骤（2）培养得到的初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并将该继代增殖培养基置于培养室中进行继代增殖培养，以获得葡萄松散型愈伤组织；

其中，步骤（2）与步骤（3）中所述培养室中的条件均为：温度设置23~25℃，光照强度1500~2000lx，每天光照12h。

进一步地，步骤（2）中所述诱导愈伤组织的培养基为：MS+BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

进一步地，步骤（3）中所述继代增殖培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

进一步地，揭露了上述所获得的葡萄松散型愈伤组织长期继代保持的方法，其操作如下：取上述步骤（3）所获得的葡萄松散型愈伤组织，并接于第一种培养基中继代保持至少2代后，转接到第二种培养基中继代保持1代，如此反复交替继代培养，即可长期继代保持葡萄松散型愈伤组织，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行；其中，所述第一种培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述第二种培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+AgNO₃ 5.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述培养室中的条件为：温度设置23~25℃，光照强度1500~2000lx，每天光照12h。